本文系統(tǒng)梳理了髓母細(xì)胞瘤分子分型的主要技術(shù)方法，涵蓋各層級策略，詳細(xì)對比了各項(xiàng)技術(shù)的原理、準(zhǔn)確性、敏感性與特異性、適用場景、樣本要求、成本及操作門檻，并重點(diǎn)分析了各方法在區(qū)分亞型的優(yōu)勢與局限。同時(shí)，文章結(jié)合臨床實(shí)踐現(xiàn)狀，指出了目前的共性挑戰(zhàn)。

分子分型是該疾病最重要的預(yù)后因素

髓母細(xì)胞瘤是一種胚胎性腫瘤，是全球兒童中第二常見的腫瘤。它的特征是腫瘤內(nèi)和腫瘤間高度異質(zhì)性。目前，世界衛(wèi)生組織認(rèn)可四個(gè)主要分子亞型（WNT型、SHH型、G3型和G4型），這些亞型賦予患者不同的臨床和預(yù)后特征。在不同人群中，已經(jīng)證明分子亞型與存活概率存在關(guān)聯(lián)：WNT型預(yù)后最佳，其次是預(yù)后中等的SHH型和G4型，G3型預(yù)后最差。而組織學(xué)分類不同，僅有一種組織學(xué)類型（間變性大細(xì)胞髓母細(xì)胞瘤）與患者不良預(yù)后相關(guān)，但該類型僅占所有腫瘤的5%-10%。

目前，髓母細(xì)胞瘤的分型采用綜合方式，涵蓋每位患者的臨床、組織學(xué)和分子特征。這是最佳的風(fēng)險(xiǎn)分層工具，也是為每位患者選擇理想治療方案的最佳方法。因此，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)已采用這種方法，納入新的化療、放療和免疫治療方案，旨在實(shí)施能提升每位患者治療方案的有效性和安全性。

因此，分子分型的鑒定已成為髓母細(xì)胞瘤臨床診療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。一旦分子亞型分類錯(cuò)誤會導(dǎo)致治療失敗，即采用強(qiáng)度過高或過低的放療和/或化療方案，將直接影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命（圖1）。

圖1 髓母細(xì)胞瘤的生物學(xué)異質(zhì)性及其臨床意義

低準(zhǔn)確度的分子分型方法

患者的診斷流程始于臨床評估和影像學(xué)檢查（如CT和MRI），隨后進(jìn)行安全范圍內(nèi)的腫瘤最大切除術(shù)。病理醫(yī)生隨后對切除組織進(jìn)行研究以明確診斷，通過分子分類進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層，最終制定治療決策。

基于影像組學(xué)特征的分子分型：在術(shù)前階段，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)基于影像學(xué)特征，開發(fā)了初步的分子分類方法，如根據(jù)腫瘤位置、造影劑增強(qiáng)情況、水腫、出血或轉(zhuǎn)移這些與分子分型相關(guān)的特征進(jìn)行分類。盡管與最終活檢結(jié)果相比，其敏感性較低（60%-70%）。

基于免疫組化的分子分型：腫瘤常規(guī)切除后，會置于甲醛中固定，隨后包埋于石蠟進(jìn)行組織病理學(xué)研究，這是經(jīng)典病理學(xué)的核心環(huán)節(jié)。免疫組化是髓母細(xì)胞瘤分類中最常用的技術(shù)之一，通過該方法可識別SHH型和WNT型髓母細(xì)胞瘤，但主要局限性在于無法區(qū)分G3型和G4型，并就此將其歸為單一亞型（非WNT/非SHH型）。

盡管免疫組化分型具有技術(shù)和經(jīng)濟(jì)可及性的特點(diǎn)，但也存在方法學(xué)局限性，如不同品牌和批次抗體的變異性、基于組織固定和包埋方法的機(jī)構(gòu)間差異，以及觀察者內(nèi)和觀察者間的可重復(fù)性，這些因素直接影響檢測的準(zhǔn)確性。例如，多項(xiàng)研究對核β-catenin陽性的臨界值設(shè)定不同（腫瘤區(qū)域的1%-50%），這可能導(dǎo)致WNT型髓母細(xì)胞瘤的鑒定出現(xiàn)分歧。同時(shí)，也存在其他類型腫瘤被錯(cuò)誤鑒定為髓母細(xì)胞瘤的情況。

基于突變譜的分子分型：通過基因組、外顯子組或靶向測序分析突變譜，是鑒定WNT型和SHH型腫瘤的另一種實(shí)用方法。90%以上的WNT型髓母細(xì)胞瘤因?yàn)榇嬖贑TNNB1突變而通過這種方法被檢測出來，而半數(shù)SHH型腫瘤存在該通路效應(yīng)蛋白編碼基因（如PTCH1、SUFU和SMO）的突變，因此可通過這種方法識別。然而，該方法不適用于G3型和G4型腫瘤的識別，因?yàn)樯形磋b定出具有足夠敏感性（<15%）的突變可用于界定這兩個(gè)分子亞型。

基于表達(dá)譜的分子分型方法

能夠以基于腫瘤表達(dá)特征區(qū)分四個(gè)分子亞型的方法，這些表達(dá)模式通過兩種技術(shù)進(jìn)行定量：無擴(kuò)增雜交系統(tǒng)（NanoString）和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。

NanoString技術(shù)：基于髓母細(xì)胞瘤的組學(xué)研究，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)致力于簡化四個(gè)分子亞型的特征基因集，其中Northcott等人的研究尤為突出，他們定義了包含25個(gè)基因的檢測組合用于分子分類。該基因組合通過NanoString nCounter平臺進(jìn)行檢測，該平臺基于生物樣本與芯片中熒光標(biāo)記探針的雜交進(jìn)行多重檢測，無需擴(kuò)增步驟。熒光信號與檢測組合中標(biāo)志物的表達(dá)相關(guān)，為每個(gè)分子亞型生成特異性表達(dá)譜。與大規(guī)模分析分類方法相比，NanoString可在90%-98%的患者中鑒定出分子亞型。影響準(zhǔn)確度的因素包括：分析冷凍組織提取的RNA時(shí)，一致性可達(dá)98%；而分析石蠟包埋組織提取的RNA時(shí)，一致性降至67%-87%，且與石蠟包埋樣本的存放時(shí)間相關(guān)。

定量PCR：2020年Cruzeiro等通過Taqman探針陣列和相對定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCRq），對同一基因組合進(jìn)行了評估。該策略與大規(guī)模分析結(jié)果的一致性達(dá)97%，其中G3型髓母細(xì)胞瘤的準(zhǔn)確度最低（88.9%）。為降低因使用多種探針的檢測組合成本，他們將基因數(shù)量限制為6個(gè)，將腫瘤分為三類：WNT型、SHH型和G3/G4型（非WNT/非SHH型）。所有WNT型病例和86%的SHH型病例獲得一致性結(jié)果。方法學(xué)上，qPCR檢測組合的部分缺點(diǎn)包括：需進(jìn)行多次分析才能確定單個(gè)樣本的分子亞型，實(shí)用性欠佳；此外，還需要高質(zhì)量、足量的樣本（腫瘤RNA）以滿足所有檢測需求。

基于表觀遺傳的分子分型方法

敏感性和特異性最高的方法是轉(zhuǎn)錄組或表觀基因組水平的大規(guī)模分析，這兩種方法均被視為參考標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用于臨床實(shí)踐和研究方案中。它們的共同優(yōu)勢在于，部分方法已用于大規(guī)模隊(duì)列分類，這有助于結(jié)果的生物信息學(xué)分析，進(jìn)而促進(jìn)其在新醫(yī)療中心的應(yīng)用。

基于表觀遺傳變化的分子分型：用于髓母細(xì)胞瘤表觀遺傳分析的兩種技術(shù)為微陣列和基因組測序。技術(shù)層面，通過甲基化譜界定分子亞型的主要優(yōu)勢在于樣本特性：與RNA相比，DNA更穩(wěn)定。此外，核酸的可及性也是一個(gè)優(yōu)勢：DNA可從石蠟包埋組織中獲取，而活檢組織石蠟包埋是臨床診斷的常規(guī)步驟；相比之下，獲取高質(zhì)量RNA需要從新鮮組織中提取，但手術(shù)獲得的組織通常立即存放在甲醛中，這會影響RNA的完整性，因此新鮮組織往往難以獲取。

1.甲基化微陣列：甲基化微陣列分類通過亞硫酸氫鹽處理樣本與針對特定甲基化易感基因組位點(diǎn)（包括CpG島、基因體、基因間區(qū)域和啟動子）設(shè)計(jì)的探針雜交，檢測甲基化DNA區(qū)域。

髓母細(xì)胞瘤研究中使用了三種Illumina平臺：GoldenGate Cancer Panel I、450K/EPIC Human Infinium和850K/EPIC Human Infinium芯片，分別可檢測超過1505個(gè)、45萬個(gè)和85萬個(gè)甲基化位點(diǎn)。在這些平臺中，450K芯片應(yīng)用最廣泛，可對95%-100%的受檢患者進(jìn)行分子亞型劃分。2%-4%的患者因樣本量不足無法進(jìn)行分析。

對比表達(dá)微陣列分類和甲基化表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有WNT型和SHH型病例均具有兩者的相關(guān)性。然而，G3型和G4型中5%的病例存在假陽性。導(dǎo)致結(jié)果不一致的因素可能如Williamson在2022年所描述，包括：兩者分子相似性較高，或它們屬于兩個(gè)分型之間的中間分子譜系。為解決這一差異，結(jié)合其他臨床特征（年齡和性別）和生物學(xué)特征（組織學(xué)類型和基因改變）進(jìn)行補(bǔ)充分析可能有助于明確分子類型。例如，大細(xì)胞組織學(xué)特征和MYC擴(kuò)增在G3型髓母細(xì)胞瘤中占主導(dǎo)地位，但在G4型中罕見；反之，MYCN擴(kuò)增在G4型髓母細(xì)胞瘤中比G3型更常見。

與其他分類方法相比，甲基化微陣列最顯著的優(yōu)勢在于能夠區(qū)分其他類型腫瘤，如室管膜瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或星形細(xì)胞瘤，這些腫瘤在組織病理學(xué)上可能被錯(cuò)誤診斷為髓母細(xì)胞瘤，此類情況占患者的比例高達(dá)8%。因此，部分作者將該方法稱為組織學(xué)譜系劃分的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法的局限性包括：最常用的平臺（Illumina，Infinium）需至少同時(shí)處理8個(gè)樣本，這增加了單個(gè)樣本的分析成本，或?qū)е聻槭占銐驑颖疽蕴顫M芯片而延遲檢測，進(jìn)而阻礙患者的及時(shí)分子診斷和個(gè)性化治療。

2.DNA測序：獲取甲基化譜的另一種策略是基因組測序。髓母細(xì)胞瘤研究中使用了兩種平臺：Illumina和近期的牛津納米孔技術(shù)（ONT）。與甲基化微陣列類似，Illumina測序需對腫瘤DNA樣本進(jìn)行亞硫酸氫鈉預(yù)處理，以區(qū)分甲基化堿基。而ONT技術(shù)無需預(yù)先處理，可直接進(jìn)行DNA測序，消除了亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的降解風(fēng)險(xiǎn)和Illumina文庫構(gòu)建中擴(kuò)增帶來的偏倚。

除甲基化組外，ONT平臺還可用于研究其他基因組數(shù)據(jù)，如小插入缺失（indels）、結(jié)構(gòu)變異、融合基因、單核苷酸變異（SNVs）和拷貝數(shù)變異（CNVs）。后兩種改變與MYC擴(kuò)增檢測和TP53突變鑒定相關(guān)，分別是高危G3型髓母細(xì)胞瘤和SHH型髓母細(xì)胞瘤患者的特征。該技術(shù)的另一個(gè)優(yōu)勢是能夠通過自適應(yīng)采樣對特定基因組區(qū)域進(jìn)行實(shí)時(shí)測序，從而無需在文庫制備過程中進(jìn)行額外的富集步驟。這種方法可快速生成分子分類結(jié)果，通常在測序后數(shù)小時(shí)內(nèi)即可獲得，且與甲基化微陣列結(jié)果的一致性>90%。

甲基化組測序分類可在高達(dá)98%的患者中鑒定出分子亞型，G3型和G4型之間的誤判率僅為5%。由于這是一種較新的方法，僅在小規(guī)模髓母細(xì)胞瘤患者隊(duì)列中得到驗(yàn)證，且分析方法基于學(xué)習(xí)模型，其結(jié)果可能受樣本量影響。分類模型的準(zhǔn)確度依賴于訓(xùn)練所用的參考數(shù)據(jù)，因此需考慮數(shù)據(jù)集中的樣本數(shù)量以及分類所涉及的類別（分子分型）數(shù)量和命名。這些局限性可通過數(shù)據(jù)共享和類別標(biāo)準(zhǔn)化的協(xié)作過程來彌補(bǔ)。此外，由于髓母細(xì)胞瘤固有的異質(zhì)性，全球人群中很可能會持續(xù)鑒定出具有中間表型的病例，導(dǎo)致分子分型劃分存在分歧。

3.最小甲基化分類器：基于甲基化模式分類的另一種工具是鑒定包含17個(gè)甲基化區(qū)域（CpG位點(diǎn)）的甲基化組特征，稱為MIMIC（Minimal Methylation Classifier）。該方法的設(shè)計(jì)基于450K/EPIC Human Infinium微陣列數(shù)據(jù)，提取四個(gè)分子亞型中甲基化變異性最大的區(qū)域，并通過Agena iPLEX技術(shù)（基于PCR和質(zhì)譜）進(jìn)行分析。

DNA樣本需預(yù)先進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理以區(qū)分甲基化胞嘧啶，目標(biāo)區(qū)域通過PCR擴(kuò)增后進(jìn)行單核苷酸延伸——甲基化區(qū)域（保留胞嘧啶）會摻入鳥嘌呤核苷酸，而非甲基化區(qū)域（轉(zhuǎn)化為尿嘧啶）會摻入胸腺嘧啶核苷酸。最后，通過質(zhì)譜分析擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)分子量確定甲基化狀態(tài)。該方法的準(zhǔn)確度為92%-98%，但由于質(zhì)譜平臺成本較高，尚未在醫(yī)療中心廣泛應(yīng)用。

基于轉(zhuǎn)錄組的分子分型方法

髓母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)錄組分析首次揭示了這四個(gè)分子亞型的存在。因此，2011年Northcott發(fā)表研究，確立了髓母細(xì)胞瘤的分子共識，每個(gè)亞型均根據(jù)其表達(dá)特征命名，缺乏特異性通路的G3型和G4型除外。表達(dá)微陣列分子分類因其高敏感性和特異性，成為首選策略之一。

表達(dá)數(shù)據(jù)微陣列：髓母細(xì)胞瘤四個(gè)分子亞型存在的首個(gè)證據(jù)來自通過HumanGene U133微陣列平臺（A版和U133 Plus 2.0版）進(jìn)行的表達(dá)譜分析。隨后，其他微陣列如Human Exon 1.0、Human Gene 1.1 ST、Human Gene 2.0 ST和Whole Human Genome 4×44 K）也被用于相關(guān)研究。這些平臺在陣列密度、識別的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量和區(qū)域方面存在差異：例如，Human Gene 2.0 ST芯片包含135萬個(gè)探針，可識別41.8萬個(gè)外顯子和4.8萬個(gè)mRNA 3'區(qū)域標(biāo)志物；而Human Exon 1.0陣列包含約550萬個(gè)探針，分布在超過100萬個(gè)外顯子中，涵蓋2009年記錄的所有轉(zhuǎn)錄本。

然而，無論使用何種陣列類型和結(jié)果解讀的生物信息學(xué)分析方法（主成分分析、非負(fù)矩陣分解或?qū)哟尉垲悾谢颊呔杀环诸悾礋o模糊病例。因此，該方法被視為髓母細(xì)胞瘤分子分類的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確度達(dá)100%。全球最大規(guī)模的隊(duì)列均通過該方法進(jìn)行分類，這為其在新中心的應(yīng)用提供了優(yōu)勢，有助于分析模型的訓(xùn)練和驗(yàn)證。

同樣，大規(guī)模分析需考慮的方面包括技術(shù)要求和基礎(chǔ)設(shè)施，這是關(guān)鍵因素。微陣列分類至少需要三種高度專業(yè)化的設(shè)備：雜交爐、流體工作站和掃描儀。此外，樣本處理的技術(shù)復(fù)雜性需要訓(xùn)練有素的人員以維持整個(gè)過程中樣本的完整性，同時(shí)需要具備專業(yè)培訓(xùn)的人員進(jìn)行結(jié)果的生物信息學(xué)分析。這對其在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用構(gòu)成了挑戰(zhàn)。

小結(jié)

本綜述旨在為不同資源條件的醫(yī)療中心提供分子分型技術(shù)選擇的參考依據(jù)，幫助其在可及范圍內(nèi)選用適宜的診斷工具。同時(shí)，通過系統(tǒng)評估現(xiàn)有方法的一致性、可重復(fù)性與誤判風(fēng)險(xiǎn)，呼吁建立多中心標(biāo)準(zhǔn)化的檢測流程與質(zhì)控體系，并推動低成本、高精度新型技術(shù)的研發(fā)與臨床轉(zhuǎn)化，以期提升髓母細(xì)胞瘤全球范圍內(nèi)的精準(zhǔn)診療水平。

參考文獻(xiàn)：Ramírez-Chiquito JC, Juárez-Méndez S. Strategies for the molecular classification of medulloblastoma.Biomedicines, 2025, 13(12): 2845. DOI:10.3390/biomedicines13122845.

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