本文系統梳理了髓母細胞瘤分子分型的主要技術方法，涵蓋各層級策略，詳細對比了各項技術的原理、準確性、敏感性與特異性、適用場景、樣本要求、成本及操作門檻，并重點分析了各方法在區分亞型的優勢與局限。同時，文章結合臨床實踐現狀，指出了目前的共性挑戰。

分子分型是該疾病最重要的預后因素

髓母細胞瘤是一種胚胎性腫瘤，是全球兒童中第二常見的腫瘤。它的特征是腫瘤內和腫瘤間高度異質性。目前，世界衛生組織認可四個主要分子亞型（WNT型、SHH型、G3型和G4型），這些亞型賦予患者不同的臨床和預后特征。在不同人群中，已經證明分子亞型與存活概率存在關聯：WNT型預后最佳，其次是預后中等的SHH型和G4型，G3型預后最差。而組織學分類不同，僅有一種組織學類型（間變性大細胞髓母細胞瘤）與患者不良預后相關，但該類型僅占所有腫瘤的5%-10%。

目前，髓母細胞瘤的分型采用綜合方式，涵蓋每位患者的臨床、組織學和分子特征。這是最佳的風險分層工具，也是為每位患者選擇理想治療方案的最佳方法。因此，多項臨床試驗已采用這種方法，納入新的化療、放療和免疫治療方案，旨在實施能提升每位患者治療方案的有效性和安全性。

因此，分子分型的鑒定已成為髓母細胞瘤臨床診療的關鍵環節。一旦分子亞型分類錯誤會導致治療失敗，即采用強度過高或過低的放療和/或化療方案，將直接影響患者的生活質量和預期壽命（圖1）。

圖1 髓母細胞瘤的生物學異質性及其臨床意義

低準確度的分子分型方法

患者的診斷流程始于臨床評估和影像學檢查（如CT和MRI），隨后進行安全范圍內的腫瘤最大切除術。病理醫生隨后對切除組織進行研究以明確診斷，通過分子分類進行風險分層，最終制定治療決策。

基于影像組學特征的分子分型：在術前階段，多個研究團隊基于影像學特征，開發了初步的分子分類方法，如根據腫瘤位置、造影劑增強情況、水腫、出血或轉移這些與分子分型相關的特征進行分類。盡管與最終活檢結果相比，其敏感性較低（60%-70%）。

基于免疫組化的分子分型：腫瘤常規切除后，會置于甲醛中固定，隨后包埋于石蠟進行組織病理學研究，這是經典病理學的核心環節。免疫組化是髓母細胞瘤分類中最常用的技術之一，通過該方法可識別SHH型和WNT型髓母細胞瘤，但主要局限性在于無法區分G3型和G4型，并就此將其歸為單一亞型（非WNT/非SHH型）。

盡管免疫組化分型具有技術和經濟可及性的特點，但也存在方法學局限性，如不同品牌和批次抗體的變異性、基于組織固定和包埋方法的機構間差異，以及觀察者內和觀察者間的可重復性，這些因素直接影響檢測的準確性。例如，多項研究對核β-catenin陽性的臨界值設定不同（腫瘤區域的1%-50%），這可能導致WNT型髓母細胞瘤的鑒定出現分歧。同時，也存在其他類型腫瘤被錯誤鑒定為髓母細胞瘤的情況。

基于突變譜的分子分型：通過基因組、外顯子組或靶向測序分析突變譜，是鑒定WNT型和SHH型腫瘤的另一種實用方法。90%以上的WNT型髓母細胞瘤因為存在CTNNB1突變而通過這種方法被檢測出來，而半數SHH型腫瘤存在該通路效應蛋白編碼基因（如PTCH1、SUFU和SMO）的突變，因此可通過這種方法識別。然而，該方法不適用于G3型和G4型腫瘤的識別，因為尚未鑒定出具有足夠敏感性（<15%）的突變可用于界定這兩個分子亞型。

基于表達譜的分子分型方法

能夠以基于腫瘤表達特征區分四個分子亞型的方法，這些表達模式通過兩種技術進行定量：無擴增雜交系統（NanoString）和聚合酶鏈反應（PCR）。

NanoString技術：基于髓母細胞瘤的組學研究，多個研究團隊致力于簡化四個分子亞型的特征基因集，其中Northcott等人的研究尤為突出，他們定義了包含25個基因的檢測組合用于分子分類。該基因組合通過NanoString nCounter平臺進行檢測，該平臺基于生物樣本與芯片中熒光標記探針的雜交進行多重檢測，無需擴增步驟。熒光信號與檢測組合中標志物的表達相關，為每個分子亞型生成特異性表達譜。與大規模分析分類方法相比，NanoString可在90%-98%的患者中鑒定出分子亞型。影響準確度的因素包括：分析冷凍組織提取的RNA時，一致性可達98%；而分析石蠟包埋組織提取的RNA時，一致性降至67%-87%，且與石蠟包埋樣本的存放時間相關。

定量PCR：2020年Cruzeiro等通過Taqman探針陣列和相對定量聚合酶鏈式反應（RT-PCRq），對同一基因組合進行了評估。該策略與大規模分析結果的一致性達97%，其中G3型髓母細胞瘤的準確度最低（88.9%）。為降低因使用多種探針的檢測組合成本，他們將基因數量限制為6個，將腫瘤分為三類：WNT型、SHH型和G3/G4型（非WNT/非SHH型）。所有WNT型病例和86%的SHH型病例獲得一致性結果。方法學上，qPCR檢測組合的部分缺點包括：需進行多次分析才能確定單個樣本的分子亞型，實用性欠佳；此外，還需要高質量、足量的樣本（腫瘤RNA）以滿足所有檢測需求。

基于表觀遺傳的分子分型方法

敏感性和特異性最高的方法是轉錄組或表觀基因組水平的大規模分析，這兩種方法均被視為參考標準，應用于臨床實踐和研究方案中。它們的共同優勢在于，部分方法已用于大規模隊列分類，這有助于結果的生物信息學分析，進而促進其在新醫療中心的應用。

基于表觀遺傳變化的分子分型：用于髓母細胞瘤表觀遺傳分析的兩種技術為微陣列和基因組測序。技術層面，通過甲基化譜界定分子亞型的主要優勢在于樣本特性：與RNA相比，DNA更穩定。此外，核酸的可及性也是一個優勢：DNA可從石蠟包埋組織中獲取，而活檢組織石蠟包埋是臨床診斷的常規步驟；相比之下，獲取高質量RNA需要從新鮮組織中提取，但手術獲得的組織通常立即存放在甲醛中，這會影響RNA的完整性，因此新鮮組織往往難以獲取。

1.甲基化微陣列：甲基化微陣列分類通過亞硫酸氫鹽處理樣本與針對特定甲基化易感基因組位點（包括CpG島、基因體、基因間區域和啟動子）設計的探針雜交，檢測甲基化DNA區域。

髓母細胞瘤研究中使用了三種Illumina平臺：GoldenGate Cancer Panel I、450K/EPIC Human Infinium和850K/EPIC Human Infinium芯片，分別可檢測超過1505個、45萬個和85萬個甲基化位點。在這些平臺中，450K芯片應用最廣泛，可對95%-100%的受檢患者進行分子亞型劃分。2%-4%的患者因樣本量不足無法進行分析。

對比表達微陣列分類和甲基化表達結果發現，所有WNT型和SHH型病例均具有兩者的相關性。然而，G3型和G4型中5%的病例存在假陽性。導致結果不一致的因素可能如Williamson在2022年所描述，包括：兩者分子相似性較高，或它們屬于兩個分型之間的中間分子譜系。為解決這一差異，結合其他臨床特征（年齡和性別）和生物學特征（組織學類型和基因改變）進行補充分析可能有助于明確分子類型。例如，大細胞組織學特征和MYC擴增在G3型髓母細胞瘤中占主導地位，但在G4型中罕見；反之，MYCN擴增在G4型髓母細胞瘤中比G3型更常見。

與其他分類方法相比，甲基化微陣列最顯著的優勢在于能夠區分其他類型腫瘤，如室管膜瘤、膠質母細胞瘤或星形細胞瘤，這些腫瘤在組織病理學上可能被錯誤診斷為髓母細胞瘤，此類情況占患者的比例高達8%。因此，部分作者將該方法稱為組織學譜系劃分的金標準。該方法的局限性包括：最常用的平臺（Illumina，Infinium）需至少同時處理8個樣本，這增加了單個樣本的分析成本，或導致為收集足夠樣本以填滿芯片而延遲檢測，進而阻礙患者的及時分子診斷和個性化治療。

2.DNA測序：獲取甲基化譜的另一種策略是基因組測序。髓母細胞瘤研究中使用了兩種平臺：Illumina和近期的牛津納米孔技術（ONT）。與甲基化微陣列類似，Illumina測序需對腫瘤DNA樣本進行亞硫酸氫鈉預處理，以區分甲基化堿基。而ONT技術無需預先處理，可直接進行DNA測序，消除了亞硫酸氫鹽轉化導致的降解風險和Illumina文庫構建中擴增帶來的偏倚。

除甲基化組外，ONT平臺還可用于研究其他基因組數據，如小插入缺失（indels）、結構變異、融合基因、單核苷酸變異（SNVs）和拷貝數變異（CNVs）。后兩種改變與MYC擴增檢測和TP53突變鑒定相關，分別是高危G3型髓母細胞瘤和SHH型髓母細胞瘤患者的特征。該技術的另一個優勢是能夠通過自適應采樣對特定基因組區域進行實時測序，從而無需在文庫制備過程中進行額外的富集步驟。這種方法可快速生成分子分類結果，通常在測序后數小時內即可獲得，且與甲基化微陣列結果的一致性>90%。

甲基化組測序分類可在高達98%的患者中鑒定出分子亞型，G3型和G4型之間的誤判率僅為5%。由于這是一種較新的方法，僅在小規模髓母細胞瘤患者隊列中得到驗證，且分析方法基于學習模型，其結果可能受樣本量影響。分類模型的準確度依賴于訓練所用的參考數據，因此需考慮數據集中的樣本數量以及分類所涉及的類別（分子分型）數量和命名。這些局限性可通過數據共享和類別標準化的協作過程來彌補。此外，由于髓母細胞瘤固有的異質性，全球人群中很可能會持續鑒定出具有中間表型的病例，導致分子分型劃分存在分歧。

3.最小甲基化分類器：基于甲基化模式分類的另一種工具是鑒定包含17個甲基化區域（CpG位點）的甲基化組特征，稱為MIMIC（Minimal Methylation Classifier）。該方法的設計基于450K/EPIC Human Infinium微陣列數據，提取四個分子亞型中甲基化變異性最大的區域，并通過Agena iPLEX技術（基于PCR和質譜）進行分析。

DNA樣本需預先進行亞硫酸氫鹽處理以區分甲基化胞嘧啶，目標區域通過PCR擴增后進行單核苷酸延伸——甲基化區域（保留胞嘧啶）會摻入鳥嘌呤核苷酸，而非甲基化區域（轉化為尿嘧啶）會摻入胸腺嘧啶核苷酸。最后，通過質譜分析擴增產物，根據分子量確定甲基化狀態。該方法的準確度為92%-98%，但由于質譜平臺成本較高，尚未在醫療中心廣泛應用。

基于轉錄組的分子分型方法

髓母細胞瘤的轉錄組分析首次揭示了這四個分子亞型的存在。因此，2011年Northcott發表研究，確立了髓母細胞瘤的分子共識，每個亞型均根據其表達特征命名，缺乏特異性通路的G3型和G4型除外。表達微陣列分子分類因其高敏感性和特異性，成為首選策略之一。

表達數據微陣列：髓母細胞瘤四個分子亞型存在的首個證據來自通過HumanGene U133微陣列平臺（A版和U133 Plus 2.0版）進行的表達譜分析。隨后，其他微陣列如Human Exon 1.0、Human Gene 1.1 ST、Human Gene 2.0 ST和Whole Human Genome 4×44 K）也被用于相關研究。這些平臺在陣列密度、識別的轉錄本數量和區域方面存在差異：例如，Human Gene 2.0 ST芯片包含135萬個探針，可識別41.8萬個外顯子和4.8萬個mRNA 3'區域標志物；而Human Exon 1.0陣列包含約550萬個探針，分布在超過100萬個外顯子中，涵蓋2009年記錄的所有轉錄本。

然而，無論使用何種陣列類型和結果解讀的生物信息學分析方法（主成分分析、非負矩陣分解或層次聚類），所有患者均可被分類，即無模糊病例。因此，該方法被視為髓母細胞瘤分子分類的金標準，準確度達100%。全球最大規模的隊列均通過該方法進行分類，這為其在新中心的應用提供了優勢，有助于分析模型的訓練和驗證。

同樣，大規模分析需考慮的方面包括技術要求和基礎設施，這是關鍵因素。微陣列分類至少需要三種高度專業化的設備：雜交爐、流體工作站和掃描儀。此外，樣本處理的技術復雜性需要訓練有素的人員以維持整個過程中樣本的完整性，同時需要具備專業培訓的人員進行結果的生物信息學分析。這對其在臨床實踐中的應用構成了挑戰。

小結

本綜述旨在為不同資源條件的醫療中心提供分子分型技術選擇的參考依據，幫助其在可及范圍內選用適宜的診斷工具。同時，通過系統評估現有方法的一致性、可重復性與誤判風險，呼吁建立多中心標準化的檢測流程與質控體系，并推動低成本、高精度新型技術的研發與臨床轉化，以期提升髓母細胞瘤全球范圍內的精準診療水平。

參考文獻：Ramírez-Chiquito JC, Juárez-Méndez S. Strategies for the molecular classification of medulloblastoma.Biomedicines, 2025, 13(12): 2845. DOI:10.3390/biomedicines13122845.

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