撰文 | 阿童木

三羧酸（TCA）循環(huán)是細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的核心樞紐，也是進(jìn)化上最為保守的生化通路之一。在有氧條件下，TCA循環(huán)在線粒體中將糖、脂肪和氨基酸分解產(chǎn)生的乙酰輔酶A徹底氧化，生成NADH和FADH?，為氧化磷酸化提供還原當(dāng)量，同時(shí)輸出多種關(guān)鍵中間體，支撐脂質(zhì)、核苷酸和非必需氨基酸的生物合成【1】。

然而，TCA循環(huán)并非一條固定不變的“封閉回路”，而是高度可塑的代謝模塊。其一，當(dāng)谷氨酰胺供應(yīng)不足或補(bǔ)料反應(yīng)（anaplerosis）受限時(shí)，細(xì)胞可通過丙酮酸羧化酶將丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，以補(bǔ)充循環(huán)中間體并維持通量【2】。其二，在缺氧或電子傳遞鏈?zhǔn)芤种魄闆r下，氧化型TCA循環(huán)受阻，細(xì)胞可利用α-酮戊二酸的還原羧化反應(yīng)逆向生成檸檬酸，從而持續(xù)為脂質(zhì)合成提供碳源【3】。其三，檸檬酸還可經(jīng)線粒體輸出至胞質(zhì)，并通過ATP-檸檬酸裂解酶裂解為乙酰輔酶A和草酰乙酸，形成“檸檬酸–蘋果酸穿梭”，將碳流從能量生成轉(zhuǎn)向脂質(zhì)合成和蛋白質(zhì)乙酰化等過程 (詳見BioArt報(bào)道：)【4】。

正是這種代謝重編程能力，使TCA循環(huán)在不同組織和生理狀態(tài)下承擔(dān)差異化功能。臨床上，TCA循環(huán)相關(guān)基因突變可導(dǎo)致從新生兒期嚴(yán)重神經(jīng)代謝障礙到成人特定腫瘤的廣泛表型譜，提示不同組織對各個(gè)代謝節(jié)點(diǎn)的依賴程度并不相同。因此，厘清TCA循環(huán)各節(jié)點(diǎn)在特定細(xì)胞環(huán)境中的功能分工，以及決定碳流究竟是留在經(jīng)典氧化模式，還是轉(zhuǎn)向檸檬酸外運(yùn)或谷氨酰胺補(bǔ)料等，將是理解相關(guān)疾病機(jī)制和開發(fā)精準(zhǔn)干預(yù)策略的關(guān)鍵。

近日，紀(jì)念斯隆凱特琳癌中心Lydia Finley實(shí)驗(yàn)室等在Cell雜志發(fā)表了題為 Citrate clearance is a major function of aconitase 2 in the canonical TCA cycle的研究文章，通過同位素示蹤和系統(tǒng)功能實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)丙酮酸氧化增強(qiáng)使線粒體檸檬酸生成上升時(shí)，細(xì)胞對ACO2的依賴顯著增強(qiáng)；其關(guān)鍵作用是促進(jìn)檸檬酸繼續(xù)向下游轉(zhuǎn)化以完成‘檸檬酸清除’，避免檸檬酸在線粒體內(nèi)堆積并激活整合應(yīng)激響應(yīng)（ISR）而損害細(xì)胞活力。這一發(fā)現(xiàn)重新定義了TCA循環(huán)的功能范疇：它不僅是生產(chǎn)能量和前體的“化工廠”，還是線粒體異常底物的“清除器”。

為了量化細(xì)胞對經(jīng)典氧化型TCA循環(huán)的參與程度，作者首先利用代謝示蹤技術(shù)，檢測了葡萄糖來源的碳原子在TCA循環(huán)第一圈的精確去向。葡萄糖經(jīng)糖酵解生成的丙酮酸進(jìn)入線粒體后，在丙酮酸脫氫酶（PDH）作用下形成標(biāo)記的乙酰輔酶A，隨后與草酰乙酸縮合生成標(biāo)記檸檬酸（cit m+2）。如果這部分檸檬酸繼續(xù)沿順向TCA路徑推進(jìn)并完成首圈氧化，下游會生成標(biāo)記蘋果酸（mal m+2）。因此，作者定義了mal+2/cit+2比值作為衡量“葡萄糖來源檸檬酸被有效氧化并捕獲在循環(huán)內(nèi)”的定量指標(biāo)。

在對82種非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞系的篩查中，研究者發(fā)現(xiàn)即便在相同的培養(yǎng)條件下，不同細(xì)胞系的mal+2/cit+2比值也存在顯著差異，且該比值與ETC及氧化磷酸化相關(guān)基因的表達(dá)水平、以及細(xì)胞的基礎(chǔ)氧耗率呈顯著正相關(guān)。作者繼續(xù)驗(yàn)證了這種相關(guān)性是否具有因果關(guān)系，發(fā)現(xiàn)使用復(fù)合物I抑制劑苯福明降低ETC通量后，mal+2/cit+2比值隨之驟降；而使用FCCP解偶聯(lián)劑增強(qiáng)電子流，則顯著提高了該比值。線粒體靶向NADH氧化酶（mitoLbNOX）的表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，通過人為加速線粒體NAD?的再生，細(xì)胞被強(qiáng)制性地提高了檸檬酸進(jìn)入順向循環(huán)氧化的比例。這些結(jié)果一致表明，線粒體電子傳遞鏈的活性及其驅(qū)動(dòng)的NAD?再生能力，是決定細(xì)胞是否傾向于通過“氧化模式”處理檸檬酸的核心限制因素。

作為依賴NAD?的脫氫酶，PDH對NAD?/NADH比例極為敏感。當(dāng)線粒體NAD?再生受阻時(shí)，丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）會介導(dǎo)PDH磷酸化從而使其失活。實(shí)驗(yàn)顯示，苯福明對PDH的抑制效應(yīng)可被mitoLbNOX逆轉(zhuǎn)。通過敲除PDK1或使用藥物抑制PDK來增強(qiáng)PDH活性，可以顯著提升mal+2/cit+2比例。有趣的是，這種通量的改變在分子水平上是由底物壓力驅(qū)動(dòng)的。由于ACO2催化反應(yīng)可逆，且在熱力學(xué)上更易積累檸檬酸一側(cè)，因此當(dāng)上游檸檬酸生成增加時(shí)，可通過質(zhì)量作用提高向下游轉(zhuǎn)化/清除的需求與依賴性。這意味著，丙酮酸氧化不僅是為了供能，它本身就是驅(qū)動(dòng)TCA循環(huán)進(jìn)行底物清除的關(guān)鍵。

這種“清除”功能的必要性在ACO2缺失模型中尤為顯著。在基礎(chǔ)條件下，ACO2的缺失對細(xì)胞生長的影響相對溫和，但一旦通過補(bǔ)充丙酮酸增強(qiáng)其上游通量，ACO2缺失的細(xì)胞便會出現(xiàn)劇烈的檸檬酸堆積，并伴隨嚴(yán)重的生長缺陷。這種缺陷并非因?yàn)橄掠未x產(chǎn)物（如α-酮戊二酸）的匱乏；相反，通過敲除檸檬酸合酶阻止檸檬酸的生成，能逆轉(zhuǎn)生長抑制。這有力地證明了，線粒體檸檬酸的過量積累會構(gòu)成關(guān)鍵的代謝負(fù)荷。增強(qiáng)SLC25A1介導(dǎo)的檸檬酸外排，或增強(qiáng)胞質(zhì)側(cè)檸檬酸代謝能力，可部分緩解表型。

那么，檸檬酸的積累是如何轉(zhuǎn)化為生長抑制信號的？研究團(tuán)隊(duì)通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，丙酮酸誘導(dǎo)的檸檬酸堆積會特異性地激活整合應(yīng)激響應(yīng)（ISR）。分子層面表現(xiàn)為eIF2α磷酸化水平升高、ATF4蛋白及其下游靶基因（如ASNS、DDIT3）的表達(dá)增強(qiáng)。更重要的是，這種應(yīng)激直接導(dǎo)致了細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯水平的急劇下降。利用L-HPG和OPP摻入實(shí)驗(yàn)觀察到，檸檬酸積累后的細(xì)胞翻譯起始受阻，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1期，進(jìn)而抑制增殖。這種從代謝物堆積到翻譯抑制的級聯(lián)反應(yīng)，揭示了檸檬酸在線粒體內(nèi)不僅是中間體，更是一個(gè)靈敏的應(yīng)激調(diào)控因子。

為了驗(yàn)證這一機(jī)制在生理和病理狀態(tài)下的普遍性，研究人員構(gòu)建了誘導(dǎo)型Aco2全身敲除小鼠。在體內(nèi)環(huán)境中，腎臟展現(xiàn)出了對這一機(jī)制的高度依賴。腎臟是體內(nèi)極少數(shù)能夠從循環(huán)系統(tǒng)中凈攝取檸檬酸的器官，其近端小管高表達(dá)檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC13A2。在Aco2敲除后，小鼠腎臟內(nèi)的檸檬酸水平飆升了8.5倍，而其他TCA中間體保持穩(wěn)定。這種特異性的積累誘發(fā)了嚴(yán)重的腎小管變性、腎損傷以及顯著的ISR激活。補(bǔ)充檸檬酸后，Aco2敲除小鼠的病情急劇惡化，壽命縮短了一半以上。這說明在具有高檸檬酸攝取或生成壓力的組織中，ACO2介導(dǎo)的清除功能是維持器官穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。

已有遺傳學(xué)與病例報(bào)道顯示，ACO2功能受損可導(dǎo)致以神經(jīng)系統(tǒng)為主的線粒體相關(guān)表型；在特定背景下也可能出現(xiàn)腎臟功能異常。作者在表達(dá)檸檬酸攝取相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)子（SLC13A2或SLC13A5）的細(xì)胞模型中驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，這類細(xì)胞對外源檸檬酸極其敏感。一旦ACO2功能受損，外部攝取的檸檬酸與內(nèi)部生成的檸檬酸共同形成的巨大壓力，會迅速擊垮細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。通過阻斷線粒體檸檬酸輸入或減少其生成，可以在實(shí)驗(yàn)室條件下逆轉(zhuǎn)這種損傷。

綜上所述，這項(xiàng)研究從根本上拓展了我們對TCA循環(huán)的理解，證明了TCA循環(huán)不僅是一個(gè)為了滿足下游需求而運(yùn)轉(zhuǎn)的“生產(chǎn)線”，其本身也承擔(dān)著清除潛在毒性代謝產(chǎn)物的職責(zé)。當(dāng)線粒體NAD?再生與丙酮酸氧化協(xié)同運(yùn)作時(shí)，TCA循環(huán)通過ACO2確保檸檬酸通量順暢，防止應(yīng)激信號ISR的錯(cuò)誤激活。這一“代謝清除”理論不僅解釋了基礎(chǔ)代謝調(diào)控的邏輯，也為治療由檸檬酸代謝紊亂引起的臨床疾病提供了全新的潛在靶點(diǎn)。TCA循環(huán)通過這種兼顧生產(chǎn)與清除的雙重設(shè)計(jì)，確保了細(xì)胞在多變的營養(yǎng)環(huán)境下的適應(yīng)性。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2026.01.028

制版人： 十一

參考文獻(xiàn)

1. Arnold, P.K., and Finley, L.W.S. (2023). Regulation and function of the mammalian tricarboxylic acid cycle. J. Biol. Chem. 299, 102838.

2. Cheng, T., et al. (2011). Pyruvate carboxylase is required for glutamine-independent growth of tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 8674–8679.

3. Metallo, C.M., et al. (2011). Reductive glutamine metabolism by IDH1 mediates lipogenesis under hypoxia. Nature 481, 380–384.

4. Arnold, P.K., et al. (2022). A non-canonical tricarboxylic acid cycle underlies cellular identity. Nature 603, 477–481.

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