撰文丨水王星

哺乳動(dòng)物的性別決定依賴于性腺體細(xì)胞的分化，這些細(xì)胞會(huì)形成性別特異性微環(huán)境，從而調(diào)控生殖細(xì)胞命運(yùn)并維持生育能力。盡管生殖細(xì)胞的遺傳性別在受精時(shí)已確定，但初期仍保持性別未分化狀態(tài)，需與性腺體細(xì)胞互作后才會(huì)獲得雌雄性別特征。 體外重構(gòu)這一關(guān)鍵過(guò)程， 不僅能為深入解析性別決定的分子機(jī)制提供重要研究平臺(tái)，也是實(shí)現(xiàn)體外配子發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。 此前，科研人員已成功從多能干細(xì)胞誘導(dǎo)出原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞（primordial germ cell–like cells，PGCLC），然而，如何在體外重建具有功能的性腺體細(xì)胞微環(huán)境，尤其是睪丸微環(huán)境，仍是生殖生物學(xué)領(lǐng)域亟待攻克的重要難題。

近日，大阪大學(xué) Takashi Yoshino 與 Katsuhiko Hayashi 課題組領(lǐng)銜在 Science 發(fā)表題為 Reconstitution of sex determination and the testicular niche using mouse pluripotent stem cells 的研究論文。該研究首次利用小鼠多能干細(xì)胞，構(gòu)建出可重構(gòu)性別決定過(guò)程的睪丸體細(xì)胞樣細(xì)胞 （Testicular somatic cell–like cells,TesLC），并將其組裝成睪丸類器官。該類器官成功支持雄性生殖細(xì)胞分化，獲得了可在體外無(wú)限增殖的生殖系干細(xì)胞樣細(xì)胞（Germline stem cell–like cells, GSCLC）。將GSCLC移植到不育小鼠體內(nèi)后，可重建精子發(fā)生過(guò)程并產(chǎn)生具備受精能力的成熟精子，最終孕育出健康可育的后代。該研究建立了完全由多能干細(xì)胞衍生的睪丸發(fā)育模型，為生殖生物學(xué)研究和生殖醫(yī)學(xué)應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

研究團(tuán)隊(duì)首先構(gòu)建了攜帶性別特異性報(bào)告基因的小鼠胚胎干細(xì)胞系，其中 Sox9-GFP (SG) 作為睪丸支持細(xì)胞的特異性標(biāo)記，F(xiàn)oxl2-tdTomato (FT) 作為卵巢顆粒細(xì)胞的特異性標(biāo)記，同時(shí)結(jié)合Nr5a1-hCD271 (Nr271)報(bào)告系統(tǒng)，可特異性標(biāo)記性別決定發(fā)生前的雙能性腺體細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，該多報(bào)告系統(tǒng)能夠精準(zhǔn)追蹤性腺體細(xì)胞的性別分化全過(guò)程。

通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，研究人員先將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)為雙能性腺狀態(tài)，隨后發(fā)現(xiàn) 抑制BMP和WNT信號(hào)通路 是誘導(dǎo)雄性分化的關(guān)鍵：聯(lián)合使用BMP受體抑制劑LDN、 Wnt 通路抑制劑IWR1和IWP2，可高效誘導(dǎo)XY胚胎干細(xì)胞分化為SOX9陽(yáng)性的睪丸支持細(xì)胞樣細(xì)胞，而XX胚胎干細(xì)胞即使延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間也無(wú)法產(chǎn)生該細(xì)胞群，證實(shí)這一分化過(guò)程 嚴(yán)格依賴Y染色體 。

為驗(yàn)證體外誘導(dǎo)的 TesLC 是否重現(xiàn)體內(nèi)睪丸發(fā)育的分子特征，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)XY胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的睪丸分化細(xì)胞（XY/ Tes ）和XX胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的卵巢分化細(xì)胞（XX/Ova）進(jìn)行 單細(xì)胞 轉(zhuǎn)錄組 分析 。UMAP聚類和 擬時(shí)序 分析顯示，誘導(dǎo)第4天的XY/ Tes 和XX/Ova細(xì)胞 轉(zhuǎn)錄組特征 高度相似，尚未出現(xiàn)性別分化差異；第5天開始出現(xiàn)共性的分化軌跡，但仍無(wú)性別特異性；第6天的XY/ Tes 細(xì)胞特異地富集于c10聚類，該聚類 高表達(dá) 睪丸支持細(xì)胞分化和功能的關(guān)鍵基因，并顯著富集于“雄性性腺發(fā)育”“性別決定”“精子發(fā)生”等生物學(xué)過(guò)程。與之相對(duì)，XX/Ova細(xì)胞在D6富集于c01聚類， 高表達(dá) 卵巢顆粒細(xì)胞標(biāo)記基因，并顯著富集于“雌性性腺發(fā)育”“視黃酸應(yīng)答”等通路。擬時(shí)序分析將分化譜系分為支持細(xì)胞譜系（Pass A）和基質(zhì)細(xì)胞譜系（Pass B），其中支持細(xì)胞譜系的XY/ Tes 細(xì)胞可從共性前體分化為雄性特異性細(xì)胞群，而 XX/Ova細(xì)胞無(wú)法完成這一過(guò)程；基質(zhì)細(xì)胞譜系則在分化過(guò)程中無(wú)性別差異，完全復(fù)刻了體內(nèi)性腺體細(xì)胞的分化軌跡。

為了評(píng)估 TesLCs 的功能，研究人員將誘導(dǎo)的 TesLC 與多能干細(xì)胞衍生的PGCLC進(jìn)行共培養(yǎng)，構(gòu)建了 睪丸類器官 。為減少 Foxl2 的異常激活（體外解離易導(dǎo)致雄性微環(huán)境向雌性偏移），研究團(tuán)隊(duì)優(yōu)化了無(wú)解離整合策略，讓PGCLC直接浸潤(rùn)到 TesLC 聚集體中。這一遷移過(guò)程由CXCR4-CXCL12趨化因子軸 介 導(dǎo)，與體內(nèi)原始生殖細(xì)胞向性腺的遷移機(jī)制保持一致。通過(guò)毒素受體 介 導(dǎo)的細(xì)胞敲除系統(tǒng)（toxin receptor-mediated cell knockout, TRECK）清除異常增殖的非性腺細(xì)胞后，睪丸類器官中出現(xiàn)了成熟的生精小管樣結(jié)構(gòu)，且生殖細(xì)胞發(fā)生了有序的雄性定向分化。

之后研究人員從培養(yǎng)28天的睪丸類器官中分離出VT陽(yáng)性的生殖細(xì)胞，在精原干細(xì)胞培養(yǎng)條件下獲得了可 無(wú)限體外增殖 的生殖系干細(xì)胞樣細(xì)胞（GSCLC），該細(xì)胞 高表達(dá) CD9、ITGA6、KIT等精原干細(xì)胞表面標(biāo)記，且可穩(wěn)定傳代。為驗(yàn)證GSCLC的體內(nèi)功能，研究團(tuán)隊(duì)將其移植到8周齡W/W?不育小鼠的生精小管中（該小鼠因c-kit突變?nèi)狈?nèi)源性生殖細(xì)胞）。移植10周后，受體小鼠的生精小管中出現(xiàn)了大量的精子發(fā)生集落，成功重建了完整的精子發(fā)生過(guò)程，并產(chǎn)生了形態(tài)正常的成熟精子。

將這些精子通過(guò)胞質(zhì)內(nèi)精子注射（ICSI）注入野生型卵母細(xì)胞， 93.8%的卵母細(xì)胞成功受精并形成雌雄原核 ，98.7%的受精卵發(fā)育至二細(xì)胞期。將75枚二細(xì)胞期胚胎移植到假孕母鼠體內(nèi)，最終獲得25只健康幼鼠（出生率36.0%），且幼鼠攜帶供體GSCLC的報(bào)告基因，證實(shí)其來(lái)源于體外誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞。所有幼鼠均可正常發(fā)育至成年，且交配后能產(chǎn)生可育的后代， 證實(shí)GSCLC具有完整的生殖系傳遞能力 。

該研究還利用體外誘導(dǎo)系統(tǒng)，揭示了 雌雄分化通路存在固有不對(duì)稱性 ：SOX9陽(yáng)性睪丸支持細(xì)胞的分化必須依賴Y染色體，XX胚胎干細(xì)胞在任何睪丸誘導(dǎo)條件下均無(wú)法產(chǎn)生雄性特異性細(xì)胞群，始終向雌性方向分化；而XY胚胎干細(xì)胞在卵巢誘導(dǎo)條件下，可高效分化為FT陽(yáng)性的卵巢顆粒細(xì)胞樣細(xì)胞（Fetal ovarian somatic cell–like cells, FOSLC），其 轉(zhuǎn)錄組特征 與XX胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的FOSLC高度相似，且能有效支持XX PGCLC分化為卵母細(xì)胞，形成次級(jí)卵泡并發(fā)育至MII期，支持卵發(fā)生的效率與XX-FOSLC無(wú)顯著差異，證實(shí)Y染色體的存在不會(huì)干擾體細(xì)胞的雌性分化及卵發(fā)生支持功能。這一發(fā)現(xiàn)表明，雄性性別決定是一個(gè)需要Y染色體觸發(fā)的主動(dòng)調(diào)控過(guò)程，而雌性分化則是相對(duì)默認(rèn)的分化路徑，為解析性別逆轉(zhuǎn)和性發(fā)育異常的分子機(jī)制提供了新視角。

該研究實(shí)現(xiàn)了無(wú)需胚胎組織，完全利用多能干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了功能性睪丸微環(huán)境的體外重構(gòu)，首次建立了可重現(xiàn)性別決定和精子發(fā)生早期過(guò)程的體外模型，解決了體外配子發(fā)生中“性腺體細(xì)胞微環(huán)境”這一核心瓶頸問(wèn)題。盡管目前體外誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞僅能進(jìn)入減數(shù)分裂前期，尚未完成完整的減數(shù)分裂產(chǎn)生單倍體精子，仍需進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件（如微器件培養(yǎng)系統(tǒng)）突破這一限制，但該研究已為生殖醫(yī)學(xué)帶來(lái)了廣闊前景，為男性不育的細(xì)胞治療、瀕危動(dòng)物的種質(zhì)資源保存等提供了新的技術(shù)思路。

原文鏈接：https://doi.org/10.1126/science.aea0296

制版人： 十一

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