Vita丨黨波波團隊發現可突破同手性識別規則的天然真核蛋白酶

2026年4月20日，西湖大學生命科學學院/西湖實驗室黨波波教授團隊在Vita發表題為Transcending Stereochemical Boundaries: Ambidextrous Cleavage of D- and L-Peptide Enantiomers by Natural Eukaryotic Proteases的研究論文，突破蛋白質同手性識別這一傳統認識原則，首次發現天然真核蛋白酶同時具有“同手性”和“異手性”識別催化能力，高效切割相同序列的L-型及D-型多肽底物，并為精準治療、診斷和分子工程提供了新的機遇。

生物體內的天然蛋白質與多肽幾乎均由 L-型氨基酸構成，其分子間相互作用通常遵循同手性識別原則。基于此，天然蛋白酶能夠高效識別并切割 L-型多肽底物，而難以作用于其鏡像形式的 D-型多肽；尤其在真核生物中，由于 D-型氨基酸極少參與天然生命過程，天然蛋白酶通常被認為缺乏對 D-型底物的識別與催化能力。這一認識構成了 D-型多肽具有高穩定性、強抗降解性并可用于藥物開發的重要理論基礎，也間接導致了近年來對于鏡像生命體系可能帶來生物安全的擔憂。

然而，這一長期被接受的傳統認知，雖與既有實驗觀察總體一致，并在領域內被廣泛沿用，但對于天然真核蛋白酶是否對 D-型底物完全缺乏識別和切割能力，仍缺少系統性的直接檢驗。針對這一問題，本研究聚焦天然真核蛋白酶對底物手性的選擇規律，系統探索天然真核蛋白酶是否存在對兩類對映體底物兼容識別與催化的能力及其分子基礎，旨在挑戰“天然真核蛋白酶不能識別和切割 D-型多肽”這一經典觀點，推動對生命體系手性識別規律的重新認識，并為 D-型多肽藥物設計及鏡像生物分子的生物學效應評估提供新的理論依據（圖1）。

圖1. 蛋白質的同手性識別與異手性識別原則示意圖

研究團隊通過構建包含多種D-型氨基酸的組合多肽庫，經多輪系統性篩選與序列優化，成功鑒定出針對人組織蛋白酶 B （ hCATB ）、木瓜蛋白酶（ Papain ）和小鼠羧酸酯酶 1c （ mCES1c ）等天然真核蛋白酶的高活性D-型多肽底物。酶學動力學分析顯示，木瓜蛋白酶、 hCATB 及mCES1c對其優選D-型多肽底物的催化效率（ k cat / K m 值 ）分別達 ( 2. 4 ± 0. 5) × 10 3 M -1 s -1 、(4.6 ± 0. 6) × 10 4 M -1 s -1 及(5.7 ? 0.6) ? 10 3 M?1 s?1 ，該效率與 TEV蛋白酶、HRV3C蛋白酶等 常用工具酶相當甚至更優 ，充分 證實 了 這類天然真核蛋白酶具備 高效的異手性催化能力 。 同時， 實驗證實三種蛋白酶 對對應 的 L- 型多 肽底物 同樣保持 高催化活性， 明確驗證了其雙 手性底物識別與催化 的獨特 功能。

為闡明蛋白酶雙手性識別的分子機制，研究團隊成功解析了 hCATB 與 D- 型五肽（ ?rkyyG? ）、 L- 型三肽（ ?YYG? ）底物的復合晶體結構（ PDB: 9XHR 、 9VA8 ），發現 D- 型與L - 型多肽分別結合于 hCATB 活性口袋的不同區域，通過形成數量不同的氫鍵及構象適配實現穩定結合（圖2）。

圖2. hCATB對D-/L-型多肽底物的穩定結合、高效水解

為進一步闡明動態識別機制，研究團隊對hCATB、木瓜蛋白酶及mCES1c與手性底物的相互作用進行了分子動力學（MD）模擬。結果顯示，hCATB與 ?rkyyG? 、 ?YYG? 的結合均保持穩定；木瓜蛋白酶對L-/D-型多肽的識別依賴 π-π 堆積作用，二者結合于同一口袋但構象不同；mCES1c則通過C端氫鍵網絡穩定L-型多肽，通過與Glu228的鹽橋作用結合D-型多肽，呈現出獨特的不對稱結合模式。這些結果表明，天然蛋白酶的手性識別機制具有系統特異性，是口袋可塑性與底物構象靈活性共同作用的結果。

在應用轉化層面，研究團隊基于篩選獲得的hCATB特異性D-型多肽底物成功開發出新型 ADC 可裂解連接子，并將其分別與曲妥珠單抗、抗 CLDN18.2 抗體偶聯，構建出高均一性的 ADC 。細胞實驗證實，該類 ADC 能特異性靶向結合 HER2 陽性或 CLDN18.2 陽性腫瘤細胞，殺傷活性與對照ADC（Val-Cit連接子）相當；體內腫瘤異種移植模型實驗進一步顯示， D -型多肽連接子 ADC 可有效抑制腫瘤生長，部分模型實現腫瘤完全緩解，療效優于對照 ADC ，這一優勢可能源于 D -型多肽連接子更優異的的小鼠血漿穩定性。該研究為解決傳統ADC存在的脫靶毒性、代謝穩定性不足等關鍵問題提供了新技術路徑，展現出良好的臨床轉化潛力。

該研究發現天然真核蛋白酶可識別并高效切割相同序列的L-/D-型多肽底物，拓展了對蛋白酶特異性的認知，證實特定場景下“雙手性”識別的存在。這為理解生物分子相互作用提供了新視角，其機制可能與分子識別起源或潛在進化相關，也為蛋白酶抑制劑、生物探針、肽基材料及前藥連接子等研究與應用奠定了新基礎，具有重要的科學價值與轉化前景。

原文鏈接：https://www.vita-journal.com/vita/EN/10.15302/vita.2026.03.0022

制版人： 十一

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