Plant Cell | 潘榮輝/沈星星/豐培強合作破解植物蛋白功能"暗物質"之謎

近日，浙江大學潘榮輝教授課題組聯合浙江大學沈星星教授課題組和中國科學院分子植物科學卓越創新中心豐培強研究員課題組在The Plant Cell期刊發表了題為Structure-guided Discovery of Protein Functions in Plants的研究論文。該研究利用人工智能預測的蛋白質三維結構，對17種代表性被子植物的56萬余個蛋白進行了系統性結構聚類與功能注釋，發現了120個在植物中廣泛保守但此前無法通過傳統序列方法注釋功能的蛋白家族。研究團隊進一步聚焦其中一個結構上與酵母過氧化物酶體蛋白PEX8高度相似的植物蛋白，通過實驗驗證了植物PEX8-like蛋白確實具有與酵母PEX8等價的功能，建立了從蛋白三維結構出發、跨越序列差異發現基因功能的研究新策略。

解析植物蛋白的功能對于基礎生物學研究和作物改良至關重要。然而，即便在模式植物擬南芥中，至今仍有約26%的蛋白功能未知。傳統的基于序列相似性的同源搜索方法，是蛋白功能注釋中長期依賴的核心手段；但當蛋白在漫長演化過程中序列發生劇烈分化、相似性顯著下降時，序列方法往往無法識別遠緣同源關系，導致大量蛋白長期處于功能未知的”暗物質”狀態。

蛋白質的三維結構在演化過程中通常比其氨基酸序列更加保守，且與分子功能更為直接相關。隨著AlphaFold等AI蛋白結構預測技術的突破性發展，從蛋白結構層面系統探索這些”暗物質”基因的功能，成為一種極具潛力的新策略。

被子植物蛋白結構圖譜的構建

研究團隊選取了17種代表性被子植物，涵蓋2種基部被子植物、6種單子葉植物和9種雙子葉植物，從AlphaFold數據庫中獲取了共564,657個蛋白質三維結構。利用FoldSeek算法對這些蛋白進行結構聚類，共獲得177,510個結構簇，其中25,825個包含兩個及以上成員的非單一簇。質量評估顯示，這些簇內部結構一致性高，中位LDDT和TM分數分別為0.84和0.74，67.6%的簇展現出100%的Pfam結構域一致性（圖1A-D）。

圖1被子植物蛋白結構聚類流程及質量評估。(A) 本研究選取的17種被子植物的分析。系統發育樹后的三組柱狀圖分別展示了蛋白質組完整性的BUSCO評估結果、蛋白質組中可用蛋白結構的數量，以及結構預測置信度分數（pLDDT）的分布。(B) 被子植物蛋白結構的聚類流程示意。去除單一成員簇后，保留了25,825個包含至少兩個成員的簇。(C) 564,657個蛋白結構中預測置信度分數（pLDDT）的累積分布。(D) 25,825個非單一簇純度的分布，分別以Pfam一致性、模板建模分數（TM-score）和局部距離差異檢驗（LDDT）進行量化。

結構引導的功能注釋：發現120個”暗物質”蛋白家族

研究團隊建立了一套嚴格的結構功能注釋流程：首先將每個結構簇的代表蛋白與Swiss-Prot數據庫（經專家手動審核的高質量蛋白注釋庫）進行結構比對和序列比對；然后篩選出那些僅能通過結構比對獲得功能信息、而無法被傳統BLAST序列搜索識別的蛋白簇（圖2A）。

經過逐層嚴格過濾——結構質量（pLDDT≥0.7，TM≥0.5）、物種覆蓋度（≥10個物種）、以及與現有數據庫（UniProtKB、TAIR、EggNOG-mapper、HHblits）的交叉驗證——最終鑒定出120個在被子植物中廣泛保守、此前功能完全未知的蛋白家族（圖2B-D）。

這些蛋白并非在生物學上無足輕重。它們的功能涵蓋蛋白結合、水解酶活性、轉移酶活性、核苷酸結合、轉運體活性等多個關鍵類別。值得注意的是，它們的結構匹配來源廣泛，涵蓋動物、真菌、細菌等多個類群，其中不少來自酵母、人類等非植物模式生物，表明蛋白結構相似性能夠跨越巨大的系統發育距離，連接不同類群間保守的分子功能（圖2E-F）。

圖2(A) 25,825個非單一簇的比對流程。(B) 3,109個結構比對結果無法被序列BLAST識別的簇的分布。篩選出的簇（橙色）滿足以下條件：（1）TM-score≥0.5，表明具有顯著的結構相似性；（2）pLDDT分數≥0.7，確保結構預測具有高置信度。(C) 1,292個篩選簇中每簇包含的物種數量。(D) 與多個參考數據庫進行人工交叉驗證，以排除功能注釋與其結構匹配至少部分重疊的代表蛋白/簇。(E) 120個保守簇在不同物種類型中的最佳匹配分布，以及蛋白的預測亞細胞定位。(F) 120個被子植物簇中分子功能計數前10的GO術語。

跨界發現新蛋白功能

研究揭示了多個蛋白功能發現案例：

1. 植物體內可能存在酵母型RNA三磷酸酶。Cluster_12521與裂殖酵母的PCT1（RNA 5′三磷酸酶）結構高度相似。此前，植物中僅發現了哺乳動物型的mRNA加帽酶（ARCP1/ARCP2），而酵母型三磷酸酶從未在植物中被鑒定。這一發現提示被子植物可能同時擁有兩種類型的RNA三磷酸酶。（圖3A）

2. 葉綠體包膜上可能存在來自內共生祖先的孔蛋白。Cluster_12986與細菌外膜孔蛋白Omp32/OmpC結構匹配，其擬南芥成員已被實驗證實定位于葉綠體包膜。進一步分析顯示該蛋白與藍藻同源物的相似性高于大腸桿菌，暗示其可能隨葉綠體的內共生起源而被保留。（圖3B）

3. 種子植物中廣泛存在的液泡蛋白VAC8同源物。Cluster_21741與酵母液泡蛋白VAC8結構相似，后者參與液泡遺傳和蛋白靶向。有趣的是，VAC8-like蛋白在綠藻中完全缺失，在苔蘚中零星出現，在種子植物中大量擴增，卻在核心十字花目（包括擬南芥所在的十字花科）中特異丟失。（圖3C）

圖3(A) Cluster_12521與粟酒裂殖酵母（S. pombe）的RNA三磷酸酶結構匹配。(B) Cluster_12986與食酸代爾夫特菌（D. acidovorans）的OmpC結構匹配。(C) Cluster_21741與與酵母（S. pombe）液泡蛋白8（VAC8）結構匹配。圖中紅色和藍色數字分別表示TM-score和序列相似度。

植物中”缺失”的過氧化物酶體蛋白PEX8

在120個蛋白家族中，研究團隊重點關注了Cluster_10847——一個與酵母過氧化物酶體蛋白PEX8結構高度相似的植物蛋白家族。PEX8是酵母中已知的過氧化物酶體生物發生關鍵因子，但此前從未在植物中被識別，因為植物與酵母的PEX8蛋白在序列層面差異極大（圖4A）。

研究團隊通過系統的實驗驗證，證實了植物PEX8-like蛋白確為PEX8的功能等價物：

亞細胞定位：來自擬南芥、水稻和苔蘚的PEX8-like蛋白均定位于過氧化物酶體。

遺傳學分析：擬南芥pex8突變體表現為純合致死，胚胎發育停滯在心形期，與已知的其他過氧化物酶體蛋白突變體表型一致。

酵母互補實驗：來自擬南芥、水稻和苔蘚的PEX8基因均能成功互補畢赤酵母pex8突變體的生長缺陷，提供了植物PEX8確實具有PEX8功能的直接證據（圖4B）。

靶向機制保守：與酵母PEX8一致，植物PEX8不依賴PTS1信號肽即可靶向過氧化物酶體，暗示它們來自同一祖先基因。

圖4(A) 來自Cluster_10847的擬南芥PEX8-like蛋白與來自4種不同酵母（畢赤酵母Pichia pastoris、釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae、多形漢遜酵母Hansenula polymorpha和解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica）的PEX8蛋白的結構比較。(B) 擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）和小立碗蘚（Physcomitrella patens）中PEX8的蛋白結構以及野生型和突變體（以擬南芥、水稻、小立碗蘚PEX8基因回補）畢赤酵母菌株的生長分析。

綜上所述，該研究首次在植物中系統開展了基于蛋白結構的功能注釋，建立了面向植物蛋白功能發現的結構基因組學研究范式。研究不僅揭示了120個此前功能未知的保守蛋白家族，更以PEX8為例，實驗證實了結構高度保守的蛋白即便序列大幅分化，仍可保持等價的生物學功能。這些發現為植物蛋白功能的系統解析提供了重要資源，也為作物改良等應用研究提供了新的潛在分子靶點。

為方便研究者查詢和使用這些數據，研究團隊同步發布了在線數據庫（https://ai-biolab.cn），支持基于基因ID的數據檢索。

The Plant Cell

評述文章特別強調了本研究的核心發現：通過對17種被子植物超過55萬個蛋白質結構的系統聚類分析，研究團隊鑒定出120個在植物中廣泛保守、但傳統序列方法無法注釋功能的蛋白家族。其中約87個家族與動物、真菌、原生生物和細菌的蛋白具有結構同源性，另有約33個家族為植物所特有。評述還著重介紹了植物PEX8蛋白的發現——這一此前被認為在植物中不存在的過氧化物酶體關鍵蛋白，盡管與酵母PEX8在序列上高度分化，卻共享獨特的靶向機制，指向共同的祖先起源。評述認為，這一結構引導的蛋白功能發現策略代表了一種創新而強大的研究范式，有望為解答廣泛的植物研究問題開辟新途徑，推動植物生物學認知的深入發展。

浙江大學博士生陳佳榮、副研究員馮彥磊（杭州國際科創中心）、博士生張鈺嬋（已畢業）和博士后高炬燦（現為浙江工業大學副研究員）為共同第一作者。浙江大學潘榮輝教授、浙江大學沈星星教授和中國科學院分子植物科學卓越創新中心豐培強研究員為共同通訊作者。該研究受到了國家自然科學基金、浙江省自然科學基金等經費資助。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1093/plcell/koag022