醬香大曲作為醬香型白酒的糖化劑和發(fā)酵劑，其微生物群落結(jié)構(gòu)與代謝功能直接決定酒體風(fēng)味物質(zhì)的形成與品質(zhì)。在傳統(tǒng)開放式制曲過程中，曲霉屬（Aspergillus）、根霉屬（Rhizopus）、毛霉屬（Mucor）、籃狀菌屬（Talaromyces）以及畢赤酵母屬（Pichia）、酵母屬（Saccharomyces）和哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）是醬香大曲的優(yōu)勢真菌屬。

大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝功能對酒體風(fēng)味物質(zhì)形成與品質(zhì)的影響已成為白酒研究的重要方向。研究表明，大曲真菌群落呈現(xiàn)顯著的時(shí)空異質(zhì)性，群落多樣性與大曲感官評分顯著相關(guān)，群落穩(wěn)定性是保障大曲品質(zhì)的關(guān)鍵因素。在代謝功能層面，真菌群落通過復(fù)雜的酶系網(wǎng)絡(luò)驅(qū)動(dòng)大分子物質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化：淀粉酶水解提供糖類，蛋白酶產(chǎn)生氨基酸等氮源并為美拉德反應(yīng)提供底物，酯化酶則參與酯類的合成。不同真菌在代謝功能上呈現(xiàn)明顯分工，曲霉主導(dǎo)淀粉和蛋白質(zhì)水解，酵母則在醇類和酯類合成中發(fā)揮核心作用，協(xié)同形成大曲特有的酶活性和風(fēng)味化合物譜。同時(shí)，真菌代謝與吡嗪類等典型醬香化合物的生物合成途徑密切相關(guān)。然而，現(xiàn)有研究存在明顯局限性，多集中于發(fā)酵終點(diǎn)的靜態(tài)分析，缺乏對群落動(dòng)態(tài)演替過程的連續(xù)監(jiān)測；群落結(jié)構(gòu)、代謝功能與最終品質(zhì)間的因果關(guān)系尚未完全闡明。這些研究空白制約了大曲生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化和精準(zhǔn)化調(diào)控。

母曲通過定向接種功能性微生物群落保障工藝連續(xù)性和品質(zhì)穩(wěn)定性。基于發(fā)酵溫度差異，大曲形成黑曲（＞64 ℃）、黃曲（62～64 ℃）和白曲（＜62 ℃）3 種類型。黑曲在碳代謝和多糖分解方面表現(xiàn)出顯著潛力，但其風(fēng)味特性相對較差，主要與特征微生物黑曲霉（Aspergillus niger）造成的高酸度和低氨基酸氮含量相關(guān)；黃曲具有較高的酯化力、糖化力和氨基酸氮含量，其微生物群落中米曲霉（A. oryzae）和酵母有助于形成酯類化合物；白曲表現(xiàn)出高微生物多樣性和低酸度的特征，優(yōu)勢微生物毛霉和根霉等在底物分解、蛋白酶活性和風(fēng)味前體合成方面具有顯著優(yōu)勢。在代謝物和揮發(fā)性成分上3 種大曲也存在顯著差異，黑曲以醛類、酮類和酚類為特征性成分，黃曲以吡嗪類物質(zhì)為特征性成分，白曲以酯類為特征揮發(fā)性成分；非揮發(fā)性代謝物中，黑曲表現(xiàn)出豐富的有機(jī)酸、氨基酸衍生物等，而白曲富含核苷酸和小肽，黃曲以胺類和其他成分為主。因此，黑曲發(fā)酵所得酒體整體呈高酸低酯特征，白曲基酒特征則為高酯高產(chǎn)，黃曲基酒特征在各方面較為平衡穩(wěn)健。然而，這3 類母曲在傳代應(yīng)用過程中如何影響新制大曲的真菌群落演替、功能基因表達(dá)和品質(zhì)形成，目前尚缺乏深入的機(jī)理研究，制約了母曲的標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用。

針對上述問題，瀘州品創(chuàng)科技有限公司（國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心）的石灝、魏陽*、王松濤* 等以加入典型黑、黃、白大曲作為母曲的新制大曲為研究對象，對其成曲過程進(jìn)行監(jiān)控采樣，通過整合宏基因組學(xué)、理化參數(shù)和揮發(fā)性物質(zhì)分析，系統(tǒng)探究在醬香大曲發(fā)酵過程中對真菌群落及功能基因的演替機(jī)制，旨在為優(yōu)質(zhì)醬香大曲的制備提供理論依據(jù)，并為優(yōu)質(zhì)母曲產(chǎn)量提升提供科學(xué)依據(jù)。

1 不同類型母曲對醬香大曲發(fā)酵過程理化指標(biāo)的影響

如圖1所示，接種不同類型母曲對成曲過程中的理化參數(shù)具有顯著影響。發(fā)酵過程中，各組水分含量總體呈下降趨勢，但在多個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)存在顯著差異（P＜0.05）。其在0～9 d下降速率較緩，該階段是大曲發(fā)酵起始階段，微生物豐度和溫度逐步升高；而9～40 d微生物豐度和溫度保持較高水平，水分含量快速下降（圖1A）。其中MQ-YQ組水分下降速率較快，與母曲中帶入的較高豐度產(chǎn)熱微生物（如Bacillus、Aspergillus）存在關(guān)聯(lián)，加速了水分?jǐn)U散過程。

酸度呈現(xiàn)典型的大曲發(fā)酵變化模式，3 組不同類型母曲在初始階段（0 d）平均酸度由（0.21±0.02）mmol/10 g快速上升至峰值（（1.93±0.10）mmol/10 g），主要源于微生物通過糖酵解途徑產(chǎn)生的短鏈有機(jī)酸；中期（9～21 d）酸度維持波動(dòng)；后期（40 d）酸度則顯著回落至（1.17±0.15）mmol/10 g（圖1B）。值得注意的是，MQ-YQ組和MQ-BQ組的下降趨勢較為平緩，而MQ-WQ組的下降速率較快，可能歸因于兩方面的生物化學(xué)機(jī)制：1）有機(jī)酸作為前體物質(zhì)參與酯化/酮化反應(yīng)而被消耗；2）為蛋白酶系介導(dǎo)的氨基酸脫氨作用產(chǎn)生的堿性物質(zhì)對有機(jī)酸產(chǎn)生了中和效應(yīng)。

淀粉含量變化總體呈現(xiàn)下降趨勢，且在發(fā)酵過程中（0～9、9～21 d）出現(xiàn)波動(dòng)（圖1C）。這一結(jié)果可能與大曲中微生物活動(dòng)影響淀粉分解、微生物自身合成糖原等多糖以及發(fā)酵產(chǎn)生的還原劑（如美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、醛、酮）對測定方法的干擾和采樣的異質(zhì)性相關(guān)。但各組間淀粉含量呈現(xiàn)顯著差異，21～40 d時(shí)MQ-BQ組和MQ-WQ組的降解速率顯著低于MQ-YQ組，該差異可能與母曲來源的α-淀粉酶產(chǎn)生菌（如Aspergillus）的豐度差異存在直接關(guān)系。

還原糖作為核心碳源的代謝動(dòng)態(tài)標(biāo)志物，表現(xiàn)出顯著的組間和時(shí)間差異。初期還原糖平均相對含量由（1.80±0.21）%快速累積至（2.54±0.20）%，主要?dú)w因于糖化酶系的激活；中后期呈現(xiàn)波動(dòng)變化，可能與微生物群落演替引起的代謝途徑轉(zhuǎn)換有關(guān)；后期則因碳源消耗及代謝產(chǎn)物反饋抑制而持續(xù)下降（圖1D）。MQ-YQ組在多數(shù)時(shí)間段的還原糖相對含量與其他組別差異顯著，這一現(xiàn)象可能與菌群組成以及代謝酶活性有關(guān)。

如表1 所示，Y Q-4 0 d 表現(xiàn)出最高的糖化力（67 mg/（g·h））和酯化力（243 mg/（50 g·7 d）），表明其在淀粉降解與酯類風(fēng)味物質(zhì)合成方面功能突出；BQ-40 d發(fā)酵力較高（0.10 g/（0.5 g·72 h）），說明其在乙醇發(fā)酵階段具有一定優(yōu)勢；而WQ-40 d在液化力（0.07 g/（g·h））方面略高于BQ-40 d，YQ-40 d液化力也最強(qiáng)（0.11 g/（g·h））。總體來看，YQ-40 d在多項(xiàng)活性指標(biāo)中表現(xiàn)優(yōu)異，表明黃曲處理可能更有利于大曲催化活性功能的全面提升。

2 不同類型母曲對大曲發(fā)酵中真菌群落組成與演替規(guī)律的影響

2.1 真菌群落的多樣性分析

對15 個(gè)樣品通過宏基因組測序獲得了1 274 615 304 個(gè)reads，累計(jì)192.5 Gbp原始數(shù)據(jù)，通過質(zhì)控后，獲得98.4%的189.8 Gbp clean數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。如表2所示，在發(fā)酵初期（0 d）物種多樣性最高（Shannon指數(shù)均值為4.39），發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先下降后上升的波動(dòng)變化，至發(fā)酵末期（40 d）其多樣性降低（Simpson指數(shù)均值從0 d時(shí)的0.07升至0.27）。這一演化路徑與大曲發(fā)酵初期表現(xiàn)出較高的微生物多樣性，隨著發(fā)酵進(jìn)程和環(huán)境因子的變化物種多樣性顯著下降的群落更替一致。Chao1指數(shù)分析則同樣表明，物種豐富度在發(fā)酵初期最高，隨后在發(fā)酵過程中出現(xiàn)波動(dòng)，至發(fā)酵末期豐富度最低。且MQ-YQ組的總體豐度最高（Chao1指數(shù)最高）、多樣性最高（Shannon指數(shù)最高）。先前研究中發(fā)現(xiàn)物種豐富度指數(shù)Chao1從大到小為黑曲＞白曲＞黃曲。進(jìn)一步通過種水平物種數(shù)量分析驗(yàn)證，各實(shí)驗(yàn)組分別檢測到2 121（MQBQ）、2 221（MQ-YQ）個(gè)和2 193（MQ-WQ）個(gè)真菌物種（數(shù)據(jù)未列出），表明母曲類型對發(fā)酵體系的真菌物種組成存在一定影響，但其組間差異是否具備統(tǒng)計(jì)特異性仍需結(jié)合物種豐度及群落結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析。

如圖2A所示，PC1解釋了72.81%的差異，PC2解釋了11.65%的差異。3 組樣本（YQ、BQ、WQ）在坐標(biāo)空間分布上存在一定的交叉與重疊，3 組間的群落結(jié)構(gòu)差異不明顯，這與以往研究結(jié)果一致，說明3 種大曲在感官和性質(zhì)上雖然存在區(qū)別，但其真菌組成在種水平上受除溫度外的相似環(huán)境因子影響，導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)趨同。對不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的PCoA中，PC1和PC2分別解釋了72.81%與11.65%的群落差異（圖2B）。在母曲（MQ）與不同時(shí)間點(diǎn)（0、9、21、40 d）的樣本中僅40 d和MQ樣本存在重疊，其余樣本間均有明顯的分離。表明不同時(shí)間點(diǎn)的真菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異，40 d樣本與母曲具有相似的群落結(jié)構(gòu)（r＝0.595 6，P＝0.002）。表明母曲作為微生物接種源，對大曲發(fā)酵終點(diǎn)真菌群落具有顯著影響，可能在大曲生產(chǎn)工藝中起到維持微生物群落代際傳承的關(guān)鍵作用。

2.2 真菌群落結(jié)構(gòu)分析

基于系統(tǒng)分類學(xué)分析，本研究共鑒定出門（29 種）、屬（997 種）、種（2 282 種）真菌。在所有樣本中，子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、未分類真核生物（unclassified_d__Eukaryota）四大類群占據(jù)主導(dǎo)地位，累計(jì)相對豐度介于84.6%～99.8%之間（圖3A）。其中，在發(fā)酵初期Basidiomycota和Ascomycota占比大于68%；發(fā)酵中期Ascomycota為優(yōu)勢門；而母曲和發(fā)酵末期中Ascomycota和Mucoromycota占比較大。

通過屬水平群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，真菌群落呈現(xiàn)出清晰的階段性演替特征（圖3B）。發(fā)酵初始階段（0 d），所有樣品均以來源于原料的柄銹菌屬（Puccinia）為共有優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞27.2%）。至第9 天，其豐度急劇下降至可忽略水平（相對豐度＜0.01%，P＜0.001），表明環(huán)境菌群被發(fā)酵功能菌群成功替代。此時(shí)，共有優(yōu)勢菌屬演替為Aspergillus、擬青霉屬（Paecilomyces）、Rasamsonia、Talaromyces及青霉屬（Penicillium）等釀造核心功能屬。第21天時(shí)，3 組中優(yōu)勢菌屬組成與第9天相似，但各屬比例發(fā)生顯著變化：總體上Aspergillus、Paecilomyces及Penicillium的相對豐度分別升高至（19.5±3.8）%、（19.2±2.6）%和（4.8±0.3）%，而Talaromyces與Rasamsonia則下降至＜17%，反映出發(fā)酵中期群落功能的分化。發(fā)酵末期（40 d），群落結(jié)構(gòu)再次發(fā)生轉(zhuǎn)變，Mucor在MQ-BQ與MQ-WQ組中成為絕對主導(dǎo)菌屬（相對豐度為63.9%～84.9%），與第21天相比豐度大幅升高。

結(jié)合屬、種水平的群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，不同母曲類型顯著影響了群落的演替路徑和穩(wěn)定性（圖3B、C）。MQ-BQ組與MQ-YQ組均以Aspergillus、Paecilomyces、Rasamsonia、Talaromyces、Penicillium、Mucor及Trichomonascus為主要優(yōu)勢菌屬，其中Paecilomyces variotii、Rasamsonia emersonii、Pichia kudriavzevii、Mucor ambiguus、Talaromyces proteolyticus、Talaromyces pinophilus及Aspergillus oryzae在種水平占據(jù)較高比例；而MQ-WQ組則呈以Mucor、Pichia、Ascoidea及威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）為主的真菌組成模式，其中Mucor ambiguus、Pichia kudriavzevii、Ascoidea rubescens具有較高豐度。在第9天，Mucor（16.1%）是MQ-BQ組的特異性菌屬，該屬包含Mucor ambiguus，而Pichia（23.1%）在MQ-WQ組中呈現(xiàn)顯著富集，該屬包含Pichia kudriavzevii，這為不同組別風(fēng)味代謝產(chǎn)物的差異提供了微生物學(xué)依據(jù)。此外，各組群落穩(wěn)定性存在顯著差異：MQ-BQ組和MQ-WQ組的真菌群落結(jié)構(gòu)經(jīng)歷了前、中、后3 個(gè)階段的顯著變化；相比之下，MQ-YQ組在整個(gè)發(fā)酵過程中（9～40 d）保持了更高的群落穩(wěn)定性，其末期優(yōu)勢菌屬仍以Aspergillus（20.2%）、Rasamsonia（20.1%）、Talaromyces（16.3%）等為主，未出現(xiàn)Mucor絕對主導(dǎo)的現(xiàn)象。如圖3D所示，大曲發(fā)酵中真菌大多來自與母曲，并隨著發(fā)酵進(jìn)行來源于母曲中真菌占比增大；發(fā)酵終點(diǎn)（40 d）樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)與其對應(yīng)母曲的整體結(jié)構(gòu)高度相似（MQ來源真菌＞79%），證明了母曲作為發(fā)酵劑對最終產(chǎn)品微生物體系具有決定性塑造作用。

為探究不同母曲發(fā)酵大曲的真菌群落組成差異，基于線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）Effect Size（LEfSe）（LDA得分＞2.5）（圖3E、F），MQBQ、MQ-YQ和MQ-WQ組在屬水平上呈現(xiàn)顯著分化特征。MQ-YQ組的標(biāo)識(shí)性真菌屬為布氏白粉菌屬（Blumeria）和小杯盤菌屬（Lachnellula），Blumeria、Lachnellula一般來自于小麥，說明MQ-YQ組在一定程度上保留了原料的微生物特征，其真菌群落可能受到小麥和母曲為主導(dǎo)的影響；MQ-WQ組則是橫梗霉屬（Lichtheimia）、卷霉屬（Circinella）及隔孢球?qū)伲―idymosphaeria），其中大多為毛霉目（Mucorales）菌株，這與WQ的已知特征一致；MQ-BQ組在屬水平上無標(biāo)識(shí)性真菌，說明其真菌群落與其他兩組具有類似功能狀態(tài)。這種差異真菌群落最終會(huì)導(dǎo)致不同母曲發(fā)酵大曲的理化性質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)出現(xiàn)差異，直接決定大曲的品質(zhì)和風(fēng)格。

Aspergillus尤其是Aspergillus oryzae能分泌豐富的糖化酶、酸性蛋白酶和谷氨酰胺酶等，參與大曲中醇類和酯類的合成，同時(shí)對大曲中其他微生物具有協(xié)同作用。Paecilomyces（以Paecilomyces variotii為代表）和Talaromyces（以Talaromyces proteolyticus、Talaromyces pinophilus為主）同樣是糖化酶的產(chǎn)生菌，還是具有耐熱性能的真菌，能夠在高溫大曲中（60～65 ℃）保持生物活性。Penicillium也是大曲中常見的糖化酶產(chǎn)生菌，但因?yàn)楫a(chǎn)生霉味、苦味和抗生素對于大曲發(fā)酵過程具有兩面性。Rasamsonia屬中Rasamsonia emersonii是典型的纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶產(chǎn)生菌，同時(shí)也是脂肪酶產(chǎn)生菌，能夠?yàn)榘拙浦酗L(fēng)味物質(zhì)提供關(guān)鍵的脂肪酸前體。Pichia kudriavzevii通常作為主要的產(chǎn)酯酵母，能夠產(chǎn)生乙酸乙酯、乙酸甲酯、異戊醇、苯乙醇等物質(zhì)，同時(shí)也能夠參與乙醇的副發(fā)酵。因此，不同母曲類型通過調(diào)控真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響功能表達(dá)和揮發(fā)物合成，最終體現(xiàn)為大曲品質(zhì)的差異。

3 大曲發(fā)酵中真菌功能基因的母曲類型依賴性

基于碳水化合物活性酶（CAZy）數(shù)據(jù)庫的功能注釋分析表明，大曲發(fā)酵體系中CAZy的功能受接種母曲類型影響（表3）。糖苷水解酶（GH）基因家族是在所有樣本中均被檢測到且豐度最高的編碼基因，其中MQ-YQ組表現(xiàn)出高于其他組別的GH基因數(shù)量和reads。GH基因的高豐度不僅保證了淀粉等儲(chǔ)存多糖的高效水解，同時(shí)為植物纖維、細(xì)胞壁的降解提供酶學(xué)基礎(chǔ)。

屬水平貢獻(xiàn)度分析揭示，不同發(fā)酵階段的CAZy來源存在差異（圖4A～F）：在MQ-YQ組、MQ-BQ組及MQ-WQ組的發(fā)酵中后期（9～40 d），Paecilomyces、Aspergillus、Talaromyces及Rasamsonia是GH、糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）、碳水化合物酯酶（CE）及輔助活性酶（AA）的主要貢獻(xiàn)菌屬；而MQ-WQ組中的上述酶類還主要來源于Pichia及Ascoidea。據(jù)報(bào)道，在大曲發(fā)酵過程中，Ascoidea不僅能產(chǎn)生酯類物質(zhì)，還參與了糖化作用，但因其來源于作物，無法耐受較高的溫度，這與本研究中其功能多在白曲中發(fā)揮結(jié)果相對應(yīng)。多糖裂解酶（PL）的編碼基因在MQ-YQ組和MQ-BQ組的特定階段主要由Aspergillus貢獻(xiàn)（4.3%～100%），這一現(xiàn)象與Aspergillus oryzae菌株的基因組特征相符，但在其他時(shí)期則由低豐度真菌類群（相對豐度排名前10）提供。碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）的編碼基因在多數(shù)樣本中主要來源于Paecilomyces。Paecilomyces在大曲中是纖維素酶和幾丁質(zhì)酶的來源，這與本研究中CBM主要來源于Paecilomyces一致。而少數(shù)樣本顯示該功能由低豐度真菌群落承擔(dān)。這些結(jié)果表明，母曲類型通過調(diào)控功能菌屬的演替模式，進(jìn)而影響大曲發(fā)酵過程中碳水化合物代謝功能。

為深入解析接種母曲類型對大曲功能代謝的影響機(jī)制，本研究對糖化關(guān)鍵酶的微生物來源進(jìn)行分析（圖4G～I(xiàn)）。首先，α-葡萄糖苷酶（EC：3.2.1.3）作為關(guān)鍵的糖化酶，其主要編碼基因來源于Paecilomyces和Pichia。值得注意的是，MQ-BQ組在母曲階段（0 d）該酶編碼基因主要來源于Trichomonascus（24.5%）。其次，糖原磷酸化酶（EC：2.4.1.1）是催化糖原分解的限速酶，其編碼基因來源隨時(shí)間動(dòng)態(tài)演替，整體而言，其主要貢獻(xiàn)菌屬為Trichomonascus、Ascoidea、Aspergillus及Pichia。再次，α-淀粉酶（EC：3.2.1.1）的編碼基因主要來源于Rasamsonia、Paecilomyces、Aspergillus和Penicillium，其菌屬演替模式與前述兩種酶具有顯著同步性。Aspergillus、Trichomonascus和Paecilomyces已在利用宏蛋白組學(xué)解析醬香大曲糖化酶的研究中證實(shí)其對糖化作用的貢獻(xiàn)。

大曲中的揮發(fā)性物質(zhì)是白酒中風(fēng)味化合物的主要來源之一，其中揮發(fā)性物質(zhì)的含量與微生物密切相關(guān)。苯乙醇作為醬香大曲含量較高的高級醇之一，具有重要的花果香氣，有助于提升酒體協(xié)調(diào)性，被廣泛應(yīng)用于大曲揮發(fā)物研究，也是本研究中占比最大的揮發(fā)性醇類物質(zhì)（總含量為6.76 mg/kg，數(shù)據(jù)未列出），其合成主要通過Ehrlich途徑（圖5A）。通過功能注釋發(fā)現(xiàn)大曲中真菌群落參與了苯乙醛轉(zhuǎn)化為苯乙醇過程，其中包括醇脫氫酶（EC：1.1.1.2）和甲醛脫氫酶（EC：1.2.1.46和EC：1.1.1.284）。如圖5B所示，與其他兩種類型大曲相比，MQ-WQ組的醇脫氫酶編碼基因微生物來源呈現(xiàn)顯著差異，其主要來源菌屬包括Paecilomyces、Aspergillus、Pichia等。與之形成對比的是，MQ-YQ和MQ-BQ組的貢獻(xiàn)菌屬組成在發(fā)酵后期（21～40 d）趨于穩(wěn)定，且與母曲菌群結(jié)構(gòu)高度相似。其次，甲醛脫氫酶（EC：1.2.1.46）的編碼基因幾乎完全由Paecilomyces貢獻(xiàn)，但在MQ-WQ組發(fā)酵初期（0～9 d）缺失。而甲醛脫氫酶（EC：1.1.1.284）的微生物來源則表現(xiàn)出母曲差異性，MQ-YQ組主要來源于Pichia、Talaromyces及Rasamsonia；MQ-BQ組以Trichomonascus和Talaromyces為主；MQ-WQ組則由Aspergillus和Pichia主導(dǎo)。Trichomonascus已被證實(shí)與水分含量、酚類、甲酚、苯乙酮、香蘭素等關(guān)鍵香氣物質(zhì)均呈顯著正相關(guān)，提示其通過促進(jìn)特定香氣化合物形成而塑造大曲獨(dú)特風(fēng)味。

吡嗪類物質(zhì)作為醬酒中的標(biāo)志性風(fēng)味成分，相較于其他香型大曲，醬香大曲吡嗪相關(guān)化合物的含量最高，其中以四甲基吡嗪含量最高，能夠提供典型的堅(jiān)果烘烤香味。通過功能注釋發(fā)現(xiàn)大曲中真菌群落參與由吡嗪到四甲基吡嗪合成途徑的酶主要有乙酰乳酸合酶（EC：2.2.1.6）、(R)-乙酰脫氫酶（EC：1.1.1.303）和(S)-乙酰脫氫酶（EC：1.1.1.304）（圖5C）。如圖5D所示，乙酰乳酸合酶（EC：2.2.1.6）的編碼基因在MQ-WQ組中主要來源于Ascoidea和Talaromyces，與MQ-YQ組的Rasamsonia及MQ-BQ組的Paecilomyces形成顯著差異。兩種乙酰脫氫酶異構(gòu)體（EC：1.1.1.303和EC：1.1.1.304）的微生物來源均呈現(xiàn)時(shí)間-空間雙重差異，(R)型在發(fā)酵初期（0～9 d）的組間差異高于中后期，而(S)型則在發(fā)酵中期（9～21 d）呈現(xiàn)菌屬趨同現(xiàn)象，主要貢獻(xiàn)菌屬為Talaromyces和Aspergillus。盡管在醬香大曲中吡嗪類物質(zhì)的合成主要是由細(xì)菌參與，但是真菌在其中也不可或缺，同時(shí)具有多維度作用。在直接作用上，真菌也能夠作為吡嗪合成關(guān)鍵酶的來源；間接作用中，真菌通過糖化和蛋白質(zhì)分解為吡嗪合成提供豐富的前體物質(zhì)，同時(shí)真菌菌絲體生長構(gòu)建的微環(huán)境為合成反應(yīng)提供了有利場所。

4 揮發(fā)性成分、理化性質(zhì)與大曲中真菌的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步探究大曲微生物群落與酶活性驅(qū)動(dòng)揮發(fā)性物質(zhì)的合成，本研究通過GC-MS測定不同類型母曲發(fā)酵大曲的揮發(fā)性成分。不同大曲樣品中初步鑒定出95 種風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類19 種、醇類17 種、酸類2 種、吡嗪類15 種、醛類17 種、酮類11 種、酚類4 種、其他類10 種。如圖6A所示，接種不同類型母曲的大曲，其成曲過程中的揮發(fā)性成分譜存在差異，且這種差異在不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)均有所體現(xiàn)。其中吡嗪類、醇類、酮類物質(zhì)占比較大。為了進(jìn)一步揭示不同大曲在分子水平上的差異，使用OPLS-DA建立模型識(shí)別大曲中關(guān)鍵揮發(fā)物。根據(jù)OPLS-DA評分圖，可以有效區(qū)分不同發(fā)酵時(shí)間段的大曲樣品揮發(fā)物的差異。其中0 d與9、21 d位于不同的象限（圖6B），表明翻曲期間揮發(fā)物的合成代謝處于高峰。此外，還進(jìn)行了排列檢驗(yàn)（n＝200）以評估判別模型的質(zhì)量。結(jié)果表明，由所有藍(lán)點(diǎn)Q2組成的回歸線在負(fù)半軸上與Y軸相交，證明模型無過擬合（圖6C）。通過VIP分析篩選出VIP＞1的揮發(fā)物，VIP值排名前5的揮發(fā)物分別為2-辛酮、苯甲醛、苯乙醇、甲基吡嗪、3-甲基丁醇。其中苯乙醇和吡嗪類物質(zhì)的合成代謝途徑等已在上述結(jié)果中有詳細(xì)描述；2-辛酮能夠呈現(xiàn)果香和堅(jiān)果香味特征，對整體香氣的平衡和復(fù)雜性有重要貢獻(xiàn)；苯甲醛具有杏仁和焦糖香氣能夠增加香氣的層次感。3-甲基丁醇作為高級醇，在白酒中具有很高的風(fēng)味稀釋因子，呈現(xiàn)出果香。

為探究微生物與風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性，本研究根據(jù)KEGG化合物分類將檢測到的風(fēng)味物質(zhì)歸為酸、醇、酯、醛、酚、酮、吡嗪、呋喃和其他共9 類。如圖7A所示，Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Mucor、Trichomonascus與吡嗪、酚類、呋喃和酮類呈正相關(guān)，與醛、酸和酯類呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），這一結(jié)果與引入高產(chǎn)吡嗪菌株強(qiáng)化大曲后風(fēng)味物質(zhì)的變化一致，這主要源于其豐富的蛋白酶體系能通過Strecker降解途徑將氨基酸轉(zhuǎn)化為吡嗪等風(fēng)味化合物；Ascoidea、Morchella及Pichia與醛和酯類呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與其特有的酯酶和乙醇脫氫酶活性密切相關(guān)。理化性質(zhì)-真菌群落相關(guān)性分析表明，酸度是影響真菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵理化性質(zhì)，優(yōu)勢菌屬（Aspergillus、Pichia、Penicillium、Talaromyces、Rasamsonia）豐度變化與酸度變化呈顯著正相關(guān)（P＜0.05、0.01）（圖7B），這可能與Aspergillus、Pichia的產(chǎn)酸代謝特征和耐酸的適應(yīng)性及真菌間的協(xié)同促進(jìn)作用有關(guān)。水分與索氏菌屬（Chorda）及Puccinia呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），但與Mucor呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），這可能因?yàn)檩^高的水分含量導(dǎo)致大曲基質(zhì)孔隙被水膜填充，阻礙氧氣擴(kuò)散，使其孢子萌發(fā)和菌絲生長受抑制。特別值得注意的是，Trichomonascus的相對豐度與淀粉含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），其可能通過α-1,4-糖苷鍵水解作用參與淀粉水解。

群落均質(zhì)化分析可用于評估不同樣品間微生物群落組成的相似性。本研究通過分析不同母曲及發(fā)酵時(shí)間真菌群落的均質(zhì)性發(fā)現(xiàn)，母曲類型對大曲真菌群落均質(zhì)性的影響不顯著（圖8A、B），表明不同母曲來源并未導(dǎo)致最終群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯分化。相比之下，發(fā)酵時(shí)間則是顯著影響群落均質(zhì)性的關(guān)鍵因素，具體表現(xiàn)為0 d與MQ之間、21 d與0 d及9 d之間的均質(zhì)性均存在顯著差異。此外，MQ-WQ組其群落均質(zhì)性變化幅度最小，說明該組在發(fā)酵過程中保持了較高的真菌群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，可能與其中優(yōu)勢真菌類群的組成和動(dòng)態(tài)變化相對保守有關(guān)。真菌群落均質(zhì)性和理化性質(zhì)的相關(guān)性結(jié)果顯示，水分與真菌群落均質(zhì)性呈顯著正相關(guān)，酸度與真菌群落均質(zhì)性呈負(fù)相關(guān)但不顯著，而真菌群落均質(zhì)性與淀粉濃度和還原糖含量相關(guān)性較弱（圖8C）。已有研究證實(shí)，水分對大曲中微生物群落組裝具有直接影響，說明水分可能是影響大曲中真菌群落組裝的因素。

為進(jìn)一步揭示調(diào)控群落均質(zhì)性的環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子，進(jìn)行了隨機(jī)森林分析。水分被確定為影響真菌群落均質(zhì)性的最關(guān)鍵理化因子（圖8D），兩者呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，表明適宜的水分條件可能通過維持微環(huán)境穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)菌絲網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)展或減弱資源競爭，從而增強(qiáng)了真菌群落的均質(zhì)性和穩(wěn)定性。相比之下，酸度等因素的影響則相對有限。更重要的是，群落結(jié)構(gòu)的變化最終指向了風(fēng)味代謝的差異。通過路徑分析解析了理化因子、優(yōu)勢真菌屬與風(fēng)味物質(zhì)之間的因果路徑（圖8E）。結(jié)果顯示，酸度是促進(jìn)高級醇合成的直接驅(qū)動(dòng)力（r＝0.803，P＜0.001），這很可能與酸性環(huán)境下酵母菌的活躍代謝有關(guān)。水分則顯著抑制了吡嗪類物質(zhì)的積累（r＝-0.688，P＜0.05），這可能是由于較低的水分條件下加速了美拉德反應(yīng)。優(yōu)勢真菌屬的豐度對兩類風(fēng)味物質(zhì)均呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)（高級醇r為-0.404；吡嗪r為-0.466）。說明風(fēng)味的形成并非由絕大多數(shù)的優(yōu)勢菌屬主導(dǎo)，而是依賴于特定功能微生物或是細(xì)菌的代謝活動(dòng)。

結(jié) 論

本研究通過解析母曲類型（黑曲、黃曲、白曲）對醬香大曲發(fā)酵過程中真菌群落、功能基因演替的影響，以及探討其與揮發(fā)性成分和理化性質(zhì)相互作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同母曲對成曲過程中理化參數(shù)具有顯著調(diào)控作用。大曲真菌群落結(jié)構(gòu)演替、CAZy基因、苯乙醇和吡嗪合成功能基因表達(dá)依賴母曲類型；MQ-YQ能有效維持以曲霉屬、Rasamsonia和籃狀菌屬為核心的穩(wěn)定真菌群落，為其較高糖化力和酯化力奠定了基礎(chǔ)。相比之下，MQ-BQ和MQ-WQ則導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)在發(fā)酵中后期發(fā)生劇烈更替。這種群落差異直接驅(qū)動(dòng)了功能基因的表達(dá)和風(fēng)味代謝的分化：MQ-YQ組的苯乙醇合成基因主要源于曲霉屬，而白曲母曲組的四甲基吡嗪合成基因則主要源于畢赤酵母屬和毛霉屬。通過隨機(jī)森林模型預(yù)測水分可能是對真菌群落具有關(guān)鍵影響的理化因素，利用路徑分析闡明了主要真菌群落和關(guān)鍵理化因素和揮發(fā)性物質(zhì)間的關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)了接種不同母曲對醬香大曲成曲過程的調(diào)控作用，從而為優(yōu)化大曲發(fā)酵工藝和優(yōu)質(zhì)母曲選育提供了理論依據(jù)。

引文格式：

石灝, 李姝, 楊陽, 等. 添加不同母曲對醬香大曲發(fā)酵過程中真菌群落及功能基因演替機(jī)制的影響[J]. 食品科學(xué), 2025, 46(24): 147-161. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250610-066.

SHI Hao, LI Shu, YANG Yang, et al. Effect of supplementing different types of mother Daqu on fungal community and functional gene succession during fermentation of Jiang-flavor Daqu[J]. Food Science, 2025, 46(24): 147-161. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250610-066.

實(shí)習(xí)編輯：林安琪；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方 閱讀原文 即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

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