CRISPR–Cas系統(tǒng)作為高效的基因編輯/調(diào)控工具，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出強大的應(yīng)用潛力。腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus, AAV）是目前FDA批準(zhǔn)用于基因治療的主要遞送載體，但其有限的容量限制了以Cas蛋白為核心的效應(yīng)工具和基因線路的包裝，制約了CRISPR–Cas系統(tǒng)的臨床應(yīng)用。

ISDra2來源的TnpB蛋白具有高度緊湊的結(jié)構(gòu)（408 aa），其體積顯著小于目前廣泛應(yīng)用的Cas蛋白。與其他Cas蛋白類似，TnpB的活性依賴其向?qū)NA（ωRNA）：ωRNA通過其spacer序列與靶DNA發(fā)生堿基互補配對，引導(dǎo)TnpB定位至鄰近靶序列識別基序（TAM）的目標(biāo)位點并發(fā)揮基因編輯作用。在基因調(diào)控應(yīng)用中，效應(yīng)功能域融合蛋白通常體積較大，采用緊湊型TnpB-ωRNA系統(tǒng)有望實現(xiàn)單AAV的體內(nèi)遞送。然而，野生型TnpB-ωRNA系統(tǒng)的基因調(diào)控和編輯效能極其有限，亟需系統(tǒng)性優(yōu)化。

近日，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院林天歆、陳旭團隊在Nature Communications發(fā)表題為Miniature and versatile genome regulation TnpB–ωRNA toolkits facilitate cancer immunotherapy的研究論文。該研究通過定向迭代工程化改造TnpB–ωRNA系統(tǒng)，開發(fā)了微型、高效的基因調(diào)控工具enTnpB，該工具可實現(xiàn)基因激活、基因編輯及堿基編輯在內(nèi)的多種功能模塊。在此基礎(chǔ)上，研究團隊進一步構(gòu)建了基于單AAV遞送的免疫激活治療工具（AAV-ImmunAct），內(nèi)源性激活腫瘤微環(huán)境中多種關(guān)鍵免疫因子表達，在人源化模型中展現(xiàn)出優(yōu)秀的抗腫瘤潛力。

本研究通過定向迭代的工程化策略，對來源于ISDra2轉(zhuǎn)座子的TnpB–ωRNA進行了系統(tǒng)性優(yōu)化。在RNA層面，研究團隊圍繞ωRNA的結(jié)構(gòu)特征開展精細(xì)化改造，包括5′端游離結(jié)構(gòu)區(qū)域截短、stem結(jié)構(gòu)重塑及關(guān)鍵堿基優(yōu)化等，最終獲得長度從231nt縮短為93 nt的增強型ωRNA（enωRNA）。在蛋白層面，基于TnpB的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)開展多輪突變篩選，鑒定出關(guān)鍵突變組合N255R/P282R，其通過增強蛋白與RNA–DNA復(fù)合體的相互作用顯著提升其靶向效率。基于RNA與蛋白的協(xié)同優(yōu)化最終構(gòu)建出增強型系統(tǒng)enTnpB，其報告基因激活能力較野生型系統(tǒng)提升達2889倍。

在此基礎(chǔ)上，研究進一步構(gòu)建了以enTnpB為核心的多功能基因調(diào)控體系，涵蓋基因激活（enTnpBa）、基因編輯（enTnpB-GE）及堿基編輯（enTnpB-ABE）等模塊。在基因激活方面，enTnpBa可在多個內(nèi)源位點實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其中部分靶基因（如IFN-γ）表達水平較對照組提升最高達1308倍。在基因編輯方面，enTnpB-GE在多個靶位點均表現(xiàn)出穩(wěn)定的indel編輯效率，較野生型系統(tǒng)提高1.33至109倍，且未檢測到顯著脫靶效應(yīng)。在堿基編輯方面，enTnpB-ABE可實現(xiàn)穩(wěn)定的A-to-G堿基轉(zhuǎn)換，堿基編輯效率較野生型大幅度提升，同樣未觀察到明顯脫靶現(xiàn)象。上述結(jié)果表明，enTnpB體系在保持小尺寸優(yōu)勢的同時，兼具高效性、特異性及多功能性，提供了全新的緊湊型基因調(diào)控工具。

研究團隊基于該體系開發(fā)了單AAV遞送的免疫激活策略（AAV-ImmunAct），旨在利用enTnpBa驅(qū)動腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵免疫因子的內(nèi)源性持續(xù)上調(diào)。實驗結(jié)果顯示，該系統(tǒng)顯著提升了CXCL9、IL-15及IFN-γ的表達，有效增強了CD8? T細(xì)胞的趨化、活化及腫瘤殺傷效應(yīng)。在類器官和人源化小鼠模型中，AAV-ImmunAct單藥治療即可顯著抑制腫瘤生長，且與抗PD-1療法聯(lián)用具有明顯的協(xié)同增效作用。

綜上所述，該研究打通了從小型核酸酶TnpB系統(tǒng)性功能優(yōu)化到體內(nèi)治療驗證的完整路徑，為緊湊型基因調(diào)控工具的發(fā)展以及AAV介導(dǎo)的基因治療和腫瘤免疫治療提供了新的技術(shù)方向與應(yīng)用前景。

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院林天歆教授、陳旭研究員為本文的共同通訊作者，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院博士后盧俊霖、博士生賴嘉健、博士后成涼和博士生詹恒基為本文共同第一作者。本研究得到了弗吉尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院李輝教授以及中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心黃林研究員的大力支持。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-026-71327-w

制版人：十一

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