細(xì)胞外囊泡（EVs）是由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外環(huán)境的具有雙層磷脂膜結(jié)構(gòu)的納米級微囊泡，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和其他生物活性成分。EVs根據(jù)其生物合成和起源分為微囊泡、凋亡小體和外泌體。起初，EVs被簡單地視作細(xì)胞處理自身廢物的系統(tǒng)。后來的研究發(fā)現(xiàn)，EVs是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)，被各種不同的機(jī)制吸收和分泌，并特異性地作用于不同的細(xì)胞。EVs充當(dāng)信號分子，參與各種生理和病理過程。此外，EVs可以作為疾病診斷的生物標(biāo)志物，作為解釋疾病發(fā)生和發(fā)展機(jī)制的切入點(diǎn)，以及作為疾病治療的載體。幾乎所有細(xì)胞在正常或病理?xiàng)l件下都可以分泌EVs。因此，EVs存在于大多數(shù)真核生物的體液中，其取樣安全、快速、方便、經(jīng)濟(jì)。EVs的磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)可以防止核酸外切酶的降解，從而能夠在體液中穩(wěn)定表達(dá)。同時，EVs生物發(fā)生可捕獲到復(fù)雜的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)分子物質(zhì)，為宿主疾病狀態(tài)提供敏感和特異的指示。

乳是一種復(fù)雜的生物流體，含有大量具有不同功能的生物成分，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)和生物活性因子。作為新生哺乳動物的主要營養(yǎng)來源，乳液具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和各種生物活性成分，其含有大量來源于乳腺上皮細(xì)胞分泌的EVs。這些乳源細(xì)胞外囊泡（M-EVs）通過內(nèi)體途徑或質(zhì)膜出芽釋放到乳中。家畜的馴化是非人類乳消費(fèi)的關(guān)鍵一步，非人類乳已成為全球飲食中必需營養(yǎng)素的重要來源。盡管當(dāng)前科學(xué)技術(shù)已對乳成分進(jìn)行了充分的挖掘，但可利用的成分與乳中存在的成分之間仍存在差距。因此，最近的研究集中在乳的隱藏特性上，其中M-EVs作為新的功能性成分越來越受到關(guān)注。近年來，M-EVs在人體代謝、免疫學(xué)和生理學(xué)中的作用已得到廣泛研究，其已被證明具有調(diào)節(jié)免疫力的作用，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖，并可作為奶牛疾病的標(biāo)志物。與其他EVs相比，M-EVs具有低免疫原性、高產(chǎn)量、穩(wěn)定的載藥率、高生物利用度，且口服即能有效到達(dá)腸道等特點(diǎn)，已發(fā)現(xiàn)M-EVs對相關(guān)受試者的健康無不良影響。此外，M-EVs可以刺激腸道生長和發(fā)育，以及通過轉(zhuǎn)運(yùn)微小RNA（miRNA）、蛋白質(zhì)和其他生物活性成分調(diào)節(jié)炎癥。M-EVs的優(yōu)越結(jié)構(gòu)特征也促進(jìn)了其作為功能性生物活性納米載體的研究進(jìn)展。M-EVs表現(xiàn)出高生產(chǎn)水平，其中牛奶EV已于美國食品和藥物管理局成功注冊。因此，M-EVs具有巨大的科研價(jià)值和應(yīng)用前景。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所的王芳、蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院的丁學(xué)智*、甘肅省婦幼保健院的安彩霞*等使用關(guān)鍵詞“milk-extracellular vesicles”在Web of Science上對2005年以來的文獻(xiàn)進(jìn)行了搜索，盡管對M-EVs的相關(guān)研究在迅速增加，但迄今為止關(guān)于M-EVs領(lǐng)域的系統(tǒng)評價(jià)相對較少，尤其是作為功能性納米載體方面。本文重點(diǎn)介紹M-EVs的形成途徑、組成特征、提取和遞送方法，并討論其作為功能性納米載體的優(yōu)勢。進(jìn)一步總結(jié)M-EVs作為遞送載體的應(yīng)用前景，同時提出需要克服的困難，旨在為M-EVs在未來的工業(yè)應(yīng)用做出貢獻(xiàn)。

1 M-EVs的生物起源、組成和特征

1.1 M-EVs的生物發(fā)生機(jī)制

M-EVs主要由乳腺上皮細(xì)胞和相關(guān)免疫細(xì)胞分泌，其內(nèi)容物的形成、封裝和釋放過程受到精細(xì)的調(diào)節(jié)。EVs的生物合成是由細(xì)胞質(zhì)膜中內(nèi)囊泡的向內(nèi)出芽啟動，這一過程被稱為內(nèi)吞作用，導(dǎo)致早期和晚期內(nèi)體按順序形成。細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷包裹了一些與細(xì)胞外環(huán)境相關(guān)的細(xì)胞表面蛋白和可溶性蛋白，形成早期內(nèi)體，然后逐漸發(fā)育為成熟的晚期內(nèi)體，最后形成多囊體（圖2）。在此期間，一些內(nèi)體的限制膜內(nèi)陷，細(xì)胞質(zhì)中的物質(zhì)被內(nèi)體分選機(jī)制選擇性包裹，形成腔內(nèi)囊泡。隨后，多囊體可以通過與溶酶體或自噬體融合并進(jìn)行降解，腔內(nèi)囊泡從細(xì)胞中釋放出來成為EVs。

1.2 M-EVs的結(jié)構(gòu)與特征

M-EVs是具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)的納米粒子，含有各種活性成分。M-EVs的表征是評估分離結(jié)果和驗(yàn)證樣品中EVs存在的關(guān)鍵步驟。用動態(tài)光散射（DLS）和透射電子顯微鏡（TEM）表征M-EVs，發(fā)現(xiàn)M-EVs的粒徑范圍為30～150 nm，呈圓形且具有杯形脂質(zhì)層。TEM是一種常用的M-EVs可視化技術(shù)。在TEM中，一束電子穿過樣品的超薄部分，通過收集并放大透射電子以創(chuàng)建圖像。這種方法有助于將M-EVs與粒徑相似的非EV顆粒區(qū)分開來，從而可以評估樣品的純度。此外，不同來源的M-EVs具有相似的大小和形態(tài)。

雖然TEM可以揭示EVs樣本中單個囊泡的粒徑，但它無法提供EVs的粒徑分布信息。納米粒子追蹤分析（NTA）和DLS是兩種常用于分析EVs粒徑分布信息的技術(shù)。NTA是一種廣泛使用的基于跟蹤液體懸浮液中顆粒的布朗運(yùn)動從而評估M-EVs粒徑分布的方法。在這種技術(shù)中，通過圖像分析，檢查與其粒徑相關(guān)的每個顆粒的運(yùn)動，高分辨率粒徑分布和濃度是NTA同時提供的兩個有價(jià)值的數(shù)據(jù)信息。盡管這項(xiàng)技術(shù)檢測速度快、樣品制備非常方便快捷，但其測量的是EVs的流體動力學(xué)半徑，因此可能無法準(zhǔn)確反映其確切粒徑。與NTA類似，DLS也是一種基于懸浮顆粒布朗運(yùn)動的成熟技術(shù)，通常用于分析M-EVs的粒徑分布和表面電荷。DLS測量的顆粒粒徑范圍較寬（1 nm～6 μm），但無法估計(jì)多分散樣品中顆粒的準(zhǔn)確粒徑。

通過蛋白質(zhì)成分確認(rèn)M-EVs的存在是其特征鑒定的重要一步。M-EVs膜表面具有MHC I類和II類，以及四次跨膜蛋白（CD9、CD86、CD63和CD81）等，并將M-EVs與乳脂球膜區(qū)分開來。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、蛋白免疫印跡、質(zhì)譜和流式細(xì)胞術(shù)是用于分析M-EVs蛋白特征的已知方法。其中，蛋白免疫印跡經(jīng)常用于評估M-EVs樣本中蛋白質(zhì)標(biāo)記物的存在。但是，在工業(yè)加工中對牛奶進(jìn)行熱處理會導(dǎo)致M-EVs的損失，可以通過脂質(zhì)甚至核酸的存在證實(shí)M-EVs。

1.3 M-EVs的組成及功能

盡管不同來源的EVs中所含物質(zhì)存在一定共性，但其組成通常具有高度特異性。與從其他來源的EVs類似，M-EVs富含蛋白質(zhì)、核酸、低聚糖、脂質(zhì)等成分。

1.3.1 蛋白質(zhì)

M-EVs中蛋白質(zhì)含量受哺乳動物種類、年齡、哺乳期、疾病和營養(yǎng)狀況的影響。一般來說，M-EVs含有參與其形成的蛋白質(zhì)（Rab鳥苷三磷酸酶（Rab GTP）、Alix和TSG101）和決定其生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)（CD9、CD86、CD63和CD81）。此外，還含有一些酶和熱休克蛋白，可能參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前，四次跨膜蛋白（CD9、CD86、CD63和CD81）已被確定為M-EVs的標(biāo)志物。同時，α-、β-和κ-酪蛋白和核糖體蛋白可被視為M-EVs的“陰性標(biāo)記”。此外，不同來源的M-EVs蛋白質(zhì)組成也存在差異，物種和哺乳期會影響M-EVs的一些蛋白質(zhì)成分。Samuel等研究發(fā)現(xiàn)與成熟乳中M-EVs的蛋白質(zhì)相比，初乳中M-EVs顯著富集了參與免疫反應(yīng)和生長的蛋白質(zhì)。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，70 種與調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞功能有關(guān)的肽在早產(chǎn)兒和足月兒乳汁樣本中表達(dá)水平不同。總之，功能蛋白在不同哺乳動物來源的M-EVs中穩(wěn)定存在，但在不同哺乳期含量發(fā)生變化。初乳中M-EVs具有較高水平的與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白，提示在未來研究M-EVs的功能或應(yīng)用時，需要區(qū)分不同哺乳期。

1.3.2 脂質(zhì)

盡管許多乳制品被脫脂，但乳中的脂質(zhì)仍然被認(rèn)為具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。例如，牛奶磷脂對嬰兒腸道和大腦發(fā)育有顯著影響。盡管EVs的形成和釋放涉及不同的機(jī)制，但都需要由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的合作驅(qū)動。EVs富含鞘脂、膽固醇和磷脂酰絲氨酸，其含量是供體細(xì)胞的2～3 倍。M-EVs的膜流動性略高于由類似成分組成的脂質(zhì)體。與蛋白質(zhì)和RNA一樣，已檢測到EVs中的脂質(zhì)也具有功能效應(yīng)，并通過模擬受體細(xì)胞的信號通路介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。例如，腫瘤來源的EVs中鞘磷脂已被證明可以調(diào)節(jié)血管活性。然而，與對M-EVs蛋白和核酸的研究相比，M-EVs脂質(zhì)的研究相對較少，并且脂質(zhì)的組成和功能在很大程度上仍未被探索。

1.3.3 核酸

核酸是構(gòu)成生命并執(zhí)行遺傳信息傳遞和其他生理功能最基本的物質(zhì)之一，主要包含在生理和病理過程中起關(guān)鍵作用的miRNA、mRNA和lncRNA。M-EVs中含有許多與免疫相關(guān)的miRNA。口服牛乳EVs可上調(diào)miRNA-320、miRNA-148、miRNA-375和let-7a的表達(dá)量，下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）中DNMT1和DNMT3的表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)腸細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞增殖，增加免疫相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)。與成熟乳相比，初乳中與免疫相關(guān)miRNA表達(dá)的水平更高。一項(xiàng)研究在牛奶中檢測到245 個miRNA，每個miRNA在不同的哺乳階段都發(fā)生顯著變化。在牛乳和豬乳的EVs中分別檢測到19 900 個和16 600 個mRNAs，并預(yù)測它們參與免疫、增殖和細(xì)胞信號傳導(dǎo)。此外，牛乳EVs中也存在大量lncRNA。lncRNA調(diào)節(jié)免疫功能、細(xì)胞間通訊、神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、繁殖和成骨細(xì)胞生成。同時，lncRNA在不同泌乳期也差異表達(dá)。消化實(shí)驗(yàn)表明，牛乳EVs中l(wèi)ncRNA在體外對多種消化液（如胰液、胃液、膽汁和唾液）具有抵抗力。由于核酸被包裹在穩(wěn)定的M-EVs中，其中的RNA可以安全到達(dá)受體被吸收并發(fā)揮其功能作用。

總體而言，M-EVs是天然的核酸載體，可以跨物種交流，這表明來自不同物種的M-EVs可以開發(fā)和用作生物活性功能物質(zhì)。進(jìn)一步闡明M-EVs的功能與特定RNA成分之間的關(guān)系，將為乳制品行業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1.3.4低聚糖

乳中低聚糖對新生免疫系統(tǒng)的發(fā)育具有積極的影響。研究母乳EVs中的低聚糖有助于深入了解母乳喂養(yǎng)與嬰兒黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)育之間的相互作用關(guān)系。M-EVs運(yùn)輸是乳中低聚糖到達(dá)受體細(xì)胞的一種非常重要的方式。然而，現(xiàn)階段對M-EVs中的低聚糖知之甚少。M-EVs蛋白糖基化研究是了解靶向遞送機(jī)制的綜合工具。Chen Wenyan等通過多種衍生化策略分析了M-EVs和乳清的O-糖、N-糖和游離寡糖，并鑒定了114 種糖蛋白，其中大多數(shù)來自M-EVs。這些研究有助于了解低聚糖在M-EVs中發(fā)揮的功能作用。

綜上所述，M-EVs脂質(zhì)具有優(yōu)良的結(jié)構(gòu)和功能特性，雖然目前已對M-EVs的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了較為全面的研究，但對其功能的研究還很有限，需要進(jìn)一步深入研究。

2 M-EVs的分離

與其他細(xì)胞分泌的EVs相比，乳中含有豐富的EVs。然而，乳中也含有大量的游離蛋白質(zhì)和脂肪，這會影響微生物的提取、分離和純化。在M-EVs的提取過程中，必須去除脂肪、細(xì)胞碎片和大部分游離蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。M-EVs的質(zhì)量取決于分離技術(shù)，穩(wěn)定和可重復(fù)的分離方法可顯著提高M(jìn)-EVs研究的可信度和應(yīng)用價(jià)值。已報(bào)道且經(jīng)過充分驗(yàn)證的分離方法包括差速離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、聚合物沉淀法、尺寸排阻色譜法和免疫親和捕獲法等，如表2所示。

2.1 差速離心法

差速離心是目前純化M-EVs最常用的方法。依次通過低速離心和高速離心，可以分離出大小均勻的M-EVs。例如，通過低速離心可以從牛奶中去除漂浮的脂肪和一些游離蛋白質(zhì)。然后，通過超速離心去除細(xì)胞碎片和大部分游離蛋白質(zhì)。經(jīng)過這種處理后，在離心管底部能夠觀察到淡黃色的果漿狀M-EVs聚集體，將其溶解在磷酸鹽緩沖液中，即獲得大量的M-EVs。差速離心易于操作，可獲得大量M-EVs，但耗時且回收率不穩(wěn)定，因此無法保證M-EVs純度。此外，由于反復(fù)的差速離心，囊泡的結(jié)構(gòu)可能會被破壞，影響其質(zhì)量。

2.2 密度梯度離心法

密度梯度離心法也稱為分區(qū)離心法，基于不同顆粒的沉降系數(shù)不同，在一定離心力的作用下，不同的顆粒在不同密度梯度的區(qū)域沉降。密度梯度離心法是通過離心管中的蔗糖溶液形成密度梯度，樣品位于頂部，在離心力的作用下，M-EVs將在1.13～1.19 g/mL的密度范圍內(nèi)富集。通過這種方法獲得的M-EVs純度很高，但該方法步驟繁瑣且耗時。

2.3 超濾離心法

在該方法中，使用特定孔徑的超濾膜，允許小分子物質(zhì)（如核酸碎片）通過，而將M-EVs截留在膜上。M-EVs通過具有特定孔徑的超濾膜進(jìn)行離心。M-EVs的相對分子質(zhì)量大于乳中大多數(shù)蛋白質(zhì)，因此利用超濾膜的不同分子質(zhì)量截留特性可以將M-EVs與其他生物大分子分離。這種方法簡單省時，并且不需要專門和昂貴的設(shè)備，但在操作過程中施加的壓力可能對EVs結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響。因此，超濾通常用于差速離心后進(jìn)一步純化M-EVs。

2.4 聚合物沉淀法

聚合物沉淀是分離M-EVs的另一種常用方法。與乙醇介導(dǎo)的核酸沉淀相同，高度親水性的聚合物與M-EVs周圍的水分子相互作用，形成疏水性微環(huán)境，導(dǎo)致M-EVs沉淀。同時，聚乙二醇是一種無毒親水性聚合物，能夠重塑周圍材料的水溶性，已廣泛應(yīng)用于ExoQuick沉淀試劑盒中。該方法不需要特殊設(shè)備，且操作簡單。但是，提取試劑盒的價(jià)格昂貴，各種蛋白質(zhì)雜質(zhì)（假陽性）和聚合物污染物是該方法需要進(jìn)一步解決的問題。

2.5 尺寸排阻色譜法

該方法的原理是利用多孔凝膠填料（如瓊脂糖、葡聚糖或聚合物微球）的孔徑差異，使樣品中的不同組分按分子或顆粒粒徑從大到小依次洗脫。當(dāng)含M-EVs的樣品通過由多孔樹脂顆粒組成的固定相時，小于固定相孔隙的顆粒進(jìn)入孔隙并被暫時攔截，大于孔徑的物質(zhì)（如M-EVs）不會進(jìn)入，使其能夠被分離和純化。與超速離心相比，尺寸排阻色譜法是一種溫和的方法，可以在不損壞的情況下分離大量M-EVs。此外，通過色譜法分離的M-EVs受到非M-EVs雜質(zhì)的污染較少。尺寸排阻色譜法純化效率及產(chǎn)物純度高，但該方法洗脫時間較長，不利于大規(guī)模樣品的分離。

2.6 尺寸排阻色譜法

免疫親和捕獲法是基于抗原-抗體的特異性反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)EVs的分離。一般基于免疫親和捕獲法的EVs分離過程主要包括：1）與EVs相關(guān)特異性抗體吸附在磁珠上捕獲EVs；2）樣品直接通過過濾柱，磁吸分離；3）用低pH值緩沖液洗脫EVs。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是具有特異性，有利于富集M-EVs。然而，也存在細(xì)胞碎片或其他顆粒，且具有價(jià)格高、產(chǎn)量低和條件相對苛刻等缺點(diǎn)。因此，這種方法主要與差速離心或其他方法結(jié)合使用，以提高富集濃度。

3 M-EVs的裝載方法

先前的研究表明，染料和小分子生物活性物質(zhì)可以通過不同的方法裝載到M-EVs中或M-EVs膜上。目前的貨物裝載方法可分為內(nèi)源性負(fù)載和外源性負(fù)載。內(nèi)源性負(fù)載是指將生物活性物質(zhì)與EVs供體細(xì)胞共孵育，使它們在EVs的生物發(fā)生過程中與EVs自發(fā)結(jié)合，然后直接分泌含有靶物質(zhì)的天然EVs。但這種方法不適用于M-EVs的生物活性物質(zhì)的裝載。外源性負(fù)載是指分離EVs后通過一系列的物理化學(xué)刺激，以實(shí)現(xiàn)生物活性物質(zhì)的裝載。外源性負(fù)載可進(jìn)一步分為被動裝載和主動裝載。前者通常僅指共孵育法，后者通常包括超聲波處理、電穿孔、反復(fù)漿融、表面活性劑滲透等方法。目前，沒有一種方法可以應(yīng)用于所有條件下藥物的負(fù)載，每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，需要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。

最簡單、有效的生物活性物質(zhì)裝載方法是共孵育，通常用于疏水分子。在共孵育過程中，生物活性物質(zhì)與EVs的疏水性脂質(zhì)雙分子層通過被動擴(kuò)散和疏水作用實(shí)現(xiàn)驅(qū)動加載。多種疏水性功能生物活性物質(zhì)如紫杉醇、姜黃素和皂苷等通過被動擴(kuò)散，可在適當(dāng)?shù)木彌_液中通過共孵育裝載到M-EVs中。然而，共孵育可能會導(dǎo)致生物活性物質(zhì)的裝載效率較低。電穿孔通過施加的電場在EVs上產(chǎn)生微孔，并在微孔恢復(fù)之前將生物活性物質(zhì)加載到EVs內(nèi)部。該方法用于將親水性物質(zhì)裝載到M-EVs中，但可能會導(dǎo)致囊泡壁結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，促進(jìn)M-EVs的分解，且裝載效率也很低。超聲波通常是將EVs與生物活性物質(zhì)通過超聲波混合后孵育混合物以恢復(fù)EVs膜，最后去除游離的生物活性物質(zhì)。然而，超聲波處理可能會導(dǎo)致EVs的裂解。miRNA、小干擾RNA（siRNA）、紫杉醇和阿霉素可以通過超聲處理裝載到EVs中。然而，超聲波和電穿孔處理會導(dǎo)致EVs聚集，生物活性物質(zhì)也黏附在EVs的表面。此外，EVs膜的完整性可能會受到破壞，從而降低其生物相容性并影響體內(nèi)靶向作用。相比之下，反復(fù)漿融是一種更溫和的方式。EVs在室溫條件下與生物活性物質(zhì)一起孵育，然后在-80 ℃或液氮中快速冷漿，然后在室溫下解漿。在漿融循環(huán)過程中，EVs中形成的冰晶會破壞EVs的膜，使生物活性物質(zhì)從膜間隙進(jìn)入管腔，并在室溫下使脂質(zhì)膜恢復(fù)完整，完成裝載。這種方法對EVs造成的機(jī)械損傷相對較小，從而獲得了適度的藥物負(fù)載。然而，該方法也會導(dǎo)致EVs中的蛋白質(zhì)降解、聚集和膜結(jié)構(gòu)變化，反復(fù)漿融過程可能會對藥物產(chǎn)生不良反應(yīng)。

此外，表面活性劑可以在EVs表面形成微孔以裝載生物活性物質(zhì)，通常用于裝載蛋白質(zhì)、肽和納米材料。這些表面活性劑可以增加EVs表面的滲透性，從而攜帶更多的藥物。此外，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%皂苷表面活性劑將疏水性生物活性物質(zhì)裝載到EVs中的效率比電穿孔高3.5 倍；然而，活性劑處理可能會在EVs中誘導(dǎo)產(chǎn)生孔隙，導(dǎo)致更高的毒性和溶血問題。此外，表面活性劑的殘留可能會造成污染，影響下游實(shí)驗(yàn)的效果。CaCl2也可用于將藥物裝載到EVs中，將EVs和藥物與100 mmol/L CaCl2溶液混合，然后在冰上孵育并進(jìn)行熱休克處理即可完成裝載。綜上所述，根據(jù)特定類型的藥物選擇適當(dāng)?shù)难b載方法以獲得M-EVs最佳裝載效率至關(guān)重要。

EVs的遞送裝載方法如圖3所示。

4 M-EVs作為天然納米遞送載體的優(yōu)勢

4.1 高生物相容性、低免疫原性和低毒性

EVs的納米級粒徑和表面攜帶分子使其具有生物相容性、免疫原性、低毒性和靶向性。例如，EVs上的CD47能夠通過抑制先天免疫系統(tǒng)的吞噬作用，延長其在循環(huán)系統(tǒng)中的滯留時間，作為防止單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬的保護(hù)機(jī)制。同時，口服M-EVs在胃腸道內(nèi)停留較長時間（12～24 h），而靜脈注射M-EVs主要積累在肝臟和腎臟中，表明M-EVs的生物學(xué)效應(yīng)可能因遞送途徑而出現(xiàn)差異。同時，小鼠靜脈注射或口服給藥M-EVs時不會誘導(dǎo)血清參數(shù)、免疫原性或全身毒性產(chǎn)生任何異常。

4.2 在加工、儲存和胃腸道條件下的穩(wěn)定性

許多藥物分子和生物制劑在體內(nèi)環(huán)境中不穩(wěn)定，不能在胃腸道中吸收而獲得預(yù)期的益處。M-EVs的天然脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)具有相對穩(wěn)定性。然而，在將EVs用作臨床遞送載體之前，確定其在體內(nèi)的安全性和有效性至關(guān)重要。大量研究已經(jīng)證明，M-EVs能夠承受胃腸道消化、加工和儲存等惡劣環(huán)境，并且比來自其他生物液體和細(xì)胞衍生的EVs穩(wěn)定性更強(qiáng)。在體外消化模型中，封裝在M-EVs中的lncRNA含量在消化液（唾液、胃液、胰液和膽汁）消化前后沒有顯著差異。同時，在消化過程中，封裝在M-EVs中的miRNA的降解量僅為游離miRNA的1/10。此外，M-EVs面對商業(yè)加工（如巴氏殺菌、均質(zhì)、超高溫處理和發(fā)酵等）表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。然而，這些加工處理可能會導(dǎo)致M-EVs表面粗糙、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)部分丟失、裝載的藥物部分降解以及胃腸道攝取減少。但是，不能否認(rèn)M-EVs作為口服給藥天然載體的優(yōu)勢，以及促進(jìn)其發(fā)揮大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)的潛力。

4.3 高生物利用度和固有靶向性

盡管M-EVs能耐受胃腸道消化降解，但其作為遞送載體，要實(shí)現(xiàn)所載藥物在人體內(nèi)的完全吸收仍面臨挑戰(zhàn)。M-EVs具有很高的穩(wěn)定性，且能克服生理障礙（胃腸道和血腦屏障），M-EVs可以保護(hù)封裝的藥物，通過利用各種攝取機(jī)制遞送到受體細(xì)胞。攝取機(jī)制包括內(nèi)吞作用、膜融合和結(jié)合表面特異性配體激活靶細(xì)胞等。研究表明，胃腸道可以吸收完整的M-EVs。M-EVs中的免疫球蛋白G可以與血管內(nèi)皮和胃腸道中的血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，從而促進(jìn)M-EVs的吸收。該原理類似于抗體通過母乳在體內(nèi)循環(huán)到嬰兒體內(nèi)。此外，M-EVs可以穿過腸黏膜并激活生物反應(yīng)信號。同時，M-EVs表面布滿了四次跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81等）和膜結(jié)合蛋白，可以有效延長其在血液中的循環(huán)時間，促進(jìn)藥物的組織靶向遞送。

4.4 大規(guī)模生產(chǎn)制造

近年來，從癌癥細(xì)胞系、淋巴細(xì)胞和干細(xì)胞中分離的EVs已被用于靶向遞送的載體。然而，細(xì)胞系產(chǎn)生的EVs含量非常低，因此很難達(dá)到商業(yè)化生產(chǎn)所需的水平。據(jù)報(bào)道，每升細(xì)胞培養(yǎng)上清液平均能夠分離出0.5～1.0 mg EVs蛋白。因此，確定合適的EVs來源，從而大量、高效和安全地分離EVs至關(guān)重要。乳是EVs的豐富來源，使用不同的提取方案，每升牛奶可以提取大約200～350 mg EVs蛋白，產(chǎn)量比細(xì)胞培養(yǎng)基中EVs的產(chǎn)量高200 倍以上。因此，與細(xì)胞系或其他生物體液相比，乳被認(rèn)為是一種非常有前途且可持續(xù)的EVs來源。

5 M-EVs遞送載體在各類疾病治療中的應(yīng)用

M-EVs的磷脂雙分子層是包埋脂溶性生物活性物質(zhì)的合適載體。多種脂溶性功能性活性物質(zhì)（如姜黃素、白藜蘆醇、魏菲靈A、花青素和紫杉醇）具有較差的水溶性、穩(wěn)定性以及快速代謝導(dǎo)致的低生物利用度，從而限制了其治療效果。大量研究表明，M-EVs的封裝提高了口服利用率，并解決了由于水溶性差而無法達(dá)到治療劑量的問題。姜黃素是一種從姜黃植物中提取的天然多酚化合物，其藥用優(yōu)勢已得到證實(shí)。M-EVs可以提高姜黃素的溶解度，使其抵抗惡劣的消化條件。與游離藥物相比，M-EVs包埋姜黃素具有更高的生物利用度。Aqil等發(fā)現(xiàn)，將姜黃素封裝到M-EVs中可以增加口服給藥后的腫瘤生長抑制性和生物利用度。最近一項(xiàng)研究表明，乳腺癌模型大鼠靜脈注射游離姜黃素后，在乳腺組織中未發(fā)現(xiàn)藥物，而M-EVs可以保護(hù)姜黃素不被代謝，并成功地將其輸送到靶組織。此外，M-EVs裝載的紫杉醇顯示出更好的治療效果，并且降低了藥物的相關(guān)毒性。紫杉醇是一種化療藥物，在許多惡性腫瘤的治療中起到至關(guān)重要的作用。與姜黃素類似，這種藥物的水溶性低，阻礙了其臨床應(yīng)用。盡管已經(jīng)采用聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL）和脫水乙醇50∶50（V/V）混合以克服這一問題，但這種組合也有副作用。另外，已獲得美國批準(zhǔn)的白蛋白結(jié)合型紫杉醇是一種不含Cremophor EL的紫杉醇納米制劑，但它與許多不良反應(yīng)有關(guān)，如過敏反應(yīng)。最近，另一項(xiàng)研究將M-EVs用于口服遞送紫杉醇，M-EVs封裝的紫杉醇在惡劣的胃腸道條件下具有良好的穩(wěn)定性。此外，與游離藥物相比，該制劑顯著抑制了肺腫瘤異種移植物模型中的腫瘤生長，并顯示出非常低的全身毒性。

M-EVs具有親水性，是水溶性藥物的合適載體。M-EVs的封裝可以保護(hù)親水性生物物質(zhì)（包括核酸、蛋白質(zhì)和肽等）免受胃腸道消化酶的降解。嵌入M-EVs的核酸對基因遞送有效，siRNA是一類新的治療方式，通過轉(zhuǎn)錄后抑制基因表達(dá)，在治療多種疾病方面表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。然而，siRNA的特點(diǎn)是細(xì)胞攝取低，并且容易受到核酸酶介導(dǎo)的降解，從而阻礙了其臨床應(yīng)用。Xiang Xuejiao等使用M-EVs遞送抗KRAS siRNA，并發(fā)現(xiàn)M-EVs中負(fù)載的siRNA穩(wěn)定，對核糖核苷酸酶A的降解具有抵抗力，并且可以顯著抑制肺癌細(xì)胞的生長。在體外，裝載在M-EVs中的β-連環(huán)蛋白siRNA可以被肝癌細(xì)胞吸收，對靶基因的表達(dá)具有極好的敲除效率。同時，在大鼠中，負(fù)載胰島素的M-EVs可以有效地通過腸黏膜運(yùn)輸，并且口服給藥比皮下注射胰島素顯示出更佳、更持久的降血糖作用。此外，M-EVs包埋奧曲肽、利拉魯肽和鮭魚降鈣素等親水性藥物時也表現(xiàn)出有效的負(fù)載能力和持續(xù)釋放性，顯著改善了這些藥物的跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)和口服生物利用度。

未經(jīng)修飾的M-EVs在遞送各種治療藥物方面顯示出良好的潛力，同時M-EVs的表面功能化可以將藥物精確地引導(dǎo)到靶組織，從而減少脫靶效應(yīng)，提高療效。由于葉酸受體在各種癌癥細(xì)胞中過表達(dá)，其配體葉酸已被用于靶向藥物載體。與未功能化的M-EVs相比，配體葉酸對M-EVs的功能化可顯著提高乳腺癌癥細(xì)胞對5-氟尿嘧啶和紫杉醇的攝取率，其抗癌效果也得到了改善。CD44是癌癥細(xì)胞表面的另一種過表達(dá)受體，Li Dan等用透明質(zhì)酸（一種CD44特異性配體）修飾M-EVs，并評估其對阿霉素腫瘤特異性方向的抗癌作用。與游離藥物相比，該制劑顯著促進(jìn)了阿霉素在人癌癥細(xì)胞中的積累并提高了療效，增加了CD44的表達(dá)。綜上，M-EVs可以用作低生物利用度或易降解的生物活性成分的納米載體。

6 結(jié) 語

M-EVs與其他來源的納米載體或EVs相比，具有更高的生物相容性、更低的免疫原性和毒性。此外，M-EVs的來源豐富，對惡劣的加工和消化環(huán)境更具耐受性。因此，M-EVs在開發(fā)功能性納米載體和實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)方面具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，M-EVs作為納米載體的應(yīng)用仍然有問題需要解決。未來的研究應(yīng)側(cè)重于：1）建立完整、標(biāo)準(zhǔn)的分離體系以實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)是M-EVs相關(guān)應(yīng)用需要突破的首要任務(wù)。2）牛奶的收集和處理方式可能會影響M-EVs的含量、功能甚至穩(wěn)定性。應(yīng)充分記錄生產(chǎn)過程的所有細(xì)節(jié)，包括動物的生理病理、喂養(yǎng)和飼養(yǎng)條件、牛奶類型（初乳、常乳、生牛奶、商業(yè)牛奶）和運(yùn)輸條件。3）優(yōu)化M-EVs的儲存方案，特別是明確不同形式產(chǎn)品的儲存條件，以保證M-EVs的數(shù)量、純度和生物活性。4）牛奶含有多種細(xì)菌和病毒，其注射使用時必須進(jìn)行消毒。超高溫是消毒牛奶的常用方法，但這一過程會導(dǎo)致M-EVs的損失及其形態(tài)的變化。因此，需要尋找替代方法。5）闡明成分和功能之間的關(guān)系，為合成M-EVs的功能類似物奠定基礎(chǔ)。總之，隨著研究技術(shù)的不斷進(jìn)步，M-EVs無疑是促進(jìn)功能性乳制品行業(yè)發(fā)展的、有前景的新功能成分，也是十分有利的靶向納米遞送載體。

引文格式：

王芳, 焦陽, 中拉毛草, 等. 乳源細(xì)胞外囊泡作為生物活性物質(zhì)體內(nèi)遞送載體的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2025, 46(18): 405-415. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250306-042.

WANG Fang, JIAO Yang, ZHONG Lamaocao, et al. Research progress on milk-derived extracellular vesicles as vehicles for in vivo delivery of bioactive substances[J]. Food Science, 2025, 46(18): 405-415. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250306-042.

實(shí)習(xí)編輯：陳師昀；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方 閱讀原文 即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

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