裂殖壺菌（Schizochytrium sp.）作為一類產(chǎn)油真菌，其細(xì)胞中油脂含量可達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量的50%～70%，二十二碳六烯酸（DHA）更是可占到總脂肪酸的35%～55%，因此，作為生產(chǎn)油脂的工程潛力菌株，其脂質(zhì)代謝調(diào)控的相關(guān)途徑一直是被深入研究的熱點(diǎn)。目前研究最多和較為認(rèn)可的裂殖壺菌中油脂合成途徑主要涉及2 種：合成飽和脂肪酸（SFAs）的需氧脂肪酸合酶（FAS）途徑和合成多不飽和脂肪酸（PUFAs）的厭氧聚酮合酶（PKS）途徑，但是其明確的調(diào)控機(jī)制尚未完全清晰，因此，需要從油脂合成調(diào)控的不同維度進(jìn)行深入分析。

有研究表明，脂肪酸在裂殖壺菌中的存在方式分為2 種：游離形式的脂肪酸占極少部分，大多數(shù)是通過酯化反應(yīng)裝配到磷脂和甘油三酯（TAG）上進(jìn)行積累與儲(chǔ)存。Liu Ying等對(duì)Aurantiochytrium sp.PKU#SW7和Thraustochytriidae sp. PKU#Mn16發(fā)酵生產(chǎn)DHA的脂質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DHA主要分布在中性脂質(zhì)TAG中。裂殖壺菌中DHA盡管是以TAG的形式存在，但其合成后遷移到TAG的過程與磷脂的代謝密切相關(guān)。裂殖壺菌中磷脂可以通過Kennedy途徑進(jìn)行從頭合成（圖1），包含CDP-X磷脂合成途徑和CDP-甘油二酯（DAG）磷脂合成途徑；此外，磷脂還能經(jīng)由酰基化途徑直接合成。以磷脂中極為常見的磷脂酰膽堿（PC），其可通過3-磷酸膽堿-甘油（GPC）歷經(jīng)兩步酰基化反應(yīng)得到。并且磷脂之間的轉(zhuǎn)化也很常見：PC可以通過磷脂酰乙醇胺（PE）轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)生成，PC也能夠轉(zhuǎn)化為溶血磷脂酰膽堿（LPC），磷脂酰絲氨酸（PS）與PC和PE之間也可以相互轉(zhuǎn)化。TAG的合成除了經(jīng)由Kennedy途徑，即通過二酰基甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（DGAT）對(duì)DAG的sn-3位點(diǎn)進(jìn)行酰化獲得，還可以通過磷脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（PDAT）和PC:二酰甘油膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶（PDCT）催化的PC代謝通路進(jìn)行合成。推測TAG中DHA的形成主要經(jīng)PC通路遷移轉(zhuǎn)化。由此可見，調(diào)控磷脂代謝會(huì)明顯影響裂殖壺菌的脂質(zhì)合成，這有利于闡明裂殖壺菌的油脂尤其是PUFAs的代謝調(diào)控機(jī)制。

磷脂是細(xì)胞膜的主要成分，影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性，磷脂的不同類型主要取決于其連接的疏水性脂肪酰基鏈和親水性磷酸極性基團(tuán)特性。PLD的轉(zhuǎn)磷脂酰化活性和水解活性在TAG和磷脂的代謝轉(zhuǎn)化中具有重要作用。已有研究表明PLD對(duì)植物細(xì)胞的生長和油脂合成都會(huì)產(chǎn)生影響。Lee等通過RNA干擾的方式將大豆中PLDα的表達(dá)水平下調(diào)，結(jié)果顯示PC和PE中PUFAs的占比增加，但TAG的不飽和度降低，意味著PLDα的抑制減緩了磷脂向TAG的轉(zhuǎn)化。Yang Wenyu等在亞麻薺中將2 個(gè)擬南芥磷脂酶D基因（AtPLDζ1和AtPLDζ2）進(jìn)行了共表達(dá)，同時(shí)利用14C標(biāo)記的甘油和乙酸酯探究其油脂的組裝動(dòng)力學(xué)，結(jié)果顯示新合成的脂肪酸優(yōu)先摻入到PC的sn-2位上，隨后TAG含量增加，PC脂肪酸含量降低，這表明PLD會(huì)使磷脂與甘油酯之間發(fā)生轉(zhuǎn)化。Bai Yang等在擬南芥中過表達(dá)了GmPLDγ基因以改變其甘油酯的代謝，GmPLDγ的表達(dá)會(huì)水解PC，使PC發(fā)生轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)了含有不飽和長鏈脂肪酸種子油的生產(chǎn)，增加產(chǎn)油量的同時(shí)也改變了油脂組成。目前微生物中關(guān)于PLD對(duì)油脂合成的影響研究甚少。Zhang Yiting等挖掘到了裂殖壺菌中PLD蛋白相關(guān)的2 個(gè)基因片段PLD1和PLD2，二者的調(diào)控對(duì)裂殖壺菌的代謝產(chǎn)生了不同的影響：PLD1基因的敲除對(duì)生物量和油脂產(chǎn)量影響不明顯，但提高了油脂中PUFAs的占比，其中DHA占比提高了13.3%；PLD2基因敲除后生物量降低了32.8%，油脂產(chǎn)量降低了17.6%，脂肪酸組成變化不大。這是由于二者的轉(zhuǎn)磷脂酰和水解活性偏好不同，PLD1的敲除加強(qiáng)了裂殖壺菌的磷脂合成通路，對(duì)磷脂的成分有一定影響，降低了PC占比，而提高了LPC和磷脂酰肌醇（PI）占比，有利于DHA與磷脂的裝配，從而提高DHA的積累。以上結(jié)果表明，通過PLD調(diào)控磷脂的代謝能有效影響油脂的合成。

相比其他來源的PLD，鏈霉菌來源的PLD具有較高的轉(zhuǎn)磷脂酰活性。因此，廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院的童俊、凌雪萍*、三峽公共檢驗(yàn)檢測中心的陸濤選擇將抗生鏈霉菌（Streptomyces antibioticus）來源的PLD基因（SaPLD）過表達(dá)于裂殖壺菌中，考察過表達(dá)PLD對(duì)裂殖壺菌細(xì)胞生長和油脂合成的影響。基于細(xì)胞膜形態(tài)分析PLD對(duì)細(xì)胞生長的影響，結(jié)合磷脂組學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）分析PLD過表達(dá)對(duì)脂肪酸、磷脂與TAG的代謝影響，進(jìn)而探討PLD對(duì)裂殖壺菌的生長和油脂合成的代謝調(diào)控機(jī)制。

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SaPLD的密碼子優(yōu)化及過表達(dá)菌株的篩選

為實(shí)現(xiàn)鏈霉菌來源的SaPLD基因（GenBank登錄號(hào)：D16444.1）在裂殖壺菌SR21中的高效表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)裂殖壺菌的密碼子偏好性，在保持氨基酸序列不變的前提下，對(duì)SaPLD基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，獲得長度為1 527 bp的優(yōu)化序列。優(yōu)化后的SaPLD基因由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并定向插入至pUCSP載體質(zhì)粒中，同時(shí)在基因兩端分別引入Xba I和Nhe I限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。利用Xba I和Nhe I對(duì)重組質(zhì)粒pUC-SP-SaPLD進(jìn)行雙酶切鑒定（圖2A），回收目的基因片段后，將其連接至實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pBluzeo-18S過表達(dá)載體，成功構(gòu)建pBluzeo-SaPLD-18S重組表達(dá)載體（圖2B）。隨后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，利用含氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行抗性篩選（圖3A）。挑取單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR驗(yàn)證（圖3B）。結(jié)果顯示，陽性克隆菌株能夠特異性擴(kuò)增出SaPLD基因片段，初步證實(shí)目的基因已成功整合至pBluzeo-18S載體中。最后，委托廈門鉑瑞生物科技有限公司對(duì)陽性克隆進(jìn)行Sanger測序分析，測序結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了pBluzeo-SaPLD-18S過表達(dá)載體的成功構(gòu)建。

對(duì)成功構(gòu)建的pBluzeo- SaPLD -18S過表達(dá)載體質(zhì)粒實(shí)施PCR擴(kuò)增，獲取包含18S上下游同源臂、博來霉素抗性表達(dá)框及 SaPLD 表達(dá)框的線性化DNA片段。采用電轉(zhuǎn)化技術(shù)，將該目的片段導(dǎo)入裂殖壺菌。以野生型裂殖壺菌菌株作為陰性對(duì)照，利用含博來霉素的抗性平板篩選電轉(zhuǎn)化后的菌株，成功分離獲得陽性轉(zhuǎn)化子（圖4A）。設(shè)計(jì)針對(duì)博來霉素抗性基因的特異性引物（擴(kuò)增片段長度375 bp），分別對(duì)野生型菌株和轉(zhuǎn)化菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測，并以pBluzeo- SaPLD -18S過表達(dá)載體質(zhì)粒作為陽性對(duì)照。如圖4B所示，野生型菌株基因組未擴(kuò)增出抗性基因條帶，而陽性轉(zhuǎn)化菌株則呈現(xiàn)出預(yù)期的375 bp特異性條帶。結(jié)果表明， SaPLD 基因已成功整合至裂殖壺菌基因組中，證實(shí) SaPLD 過表達(dá)菌株構(gòu)建成功。

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SaPLD過表達(dá)對(duì)裂殖壺菌及油脂積累的影響

如圖5A所示，野生型菌株在48 h開始進(jìn)入指數(shù)生長期，48～96 h期間生物量和油脂產(chǎn)量快速增長和積累，而后進(jìn)入穩(wěn)定期，油脂產(chǎn)量最高達(dá)到24.9 g/L。SaPLD過表達(dá)菌株在前72 h與野生型生長基本一致，72 h后生長變緩，比野生型延遲24 h進(jìn)入穩(wěn)定期，最終生物量比野生型低7.9%。2 株菌的總油產(chǎn)量一直在逐步積累，96 h前過表達(dá)菌株低于野生型，但后期過表達(dá)菌株總油產(chǎn)量持續(xù)增加最終超過野生型，最高總油產(chǎn)量達(dá)到25.9 g/L，比野生型提高了4.0%。

由圖5B可知， SaPLD 過表達(dá)菌株的葡萄糖消耗速率更快，在96 h就基本耗盡；而野生型菌株在48 h前葡萄糖消耗速率較慢，生長相對(duì)較慢（48 h時(shí)生物量略低于過表達(dá)菌株），隨后糖消耗開始加快，在120 h耗完所有葡萄糖。盡管突變株的糖消耗較快，但并沒有體現(xiàn)在生物量的增加上，而相對(duì)是糖消耗較慢的野生型生長更佳，這說明 SaPLD 改變了細(xì)胞糖代謝的利用途徑。由圖5C可知，2 株菌的油脂占比均隨著細(xì)胞的生長而增加，前期野生型的油脂占比高于突變株，后期突變株高于野生型，可以看出 SaPLD 過表達(dá)最終提高了裂殖壺菌的油脂占比，最高值比野生菌株提高了13.5%，這說明 SaPLD 可以提高裂殖壺菌中單位細(xì)胞合成油脂的能力。更為重要的是，從48～72 h野生型的油脂占比提高了14.0%，而突變株提高了40.1%，結(jié)合葡萄糖的消耗速率和生物量的變化，可以看出 SaPLD 的過表達(dá)使得更多的碳源進(jìn)入脂質(zhì)合成途徑，從而最終提高了突變株的油脂含量。

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SaPLD過表達(dá)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

發(fā)酵培養(yǎng)過程中觀察到SaPLD過表達(dá)細(xì)胞在72 h出現(xiàn)破裂，取樣離心后上清液渾濁，漂浮著破碎的細(xì)胞，這說明SaPLD對(duì)宿主裂殖壺菌產(chǎn)生了一定程度的毒害作用。如圖6所示，野生型菌株細(xì)胞表面光滑，形態(tài)飽滿完整，而SaPLD過表達(dá)菌株細(xì)胞表面出現(xiàn)了皺縮、破裂的情況，細(xì)胞整體尺寸也略小于野生型細(xì)胞。這表明突變株細(xì)胞膜在SaPLD作用下功能受到影響，細(xì)胞無法正常生長繁殖。Mishima等發(fā)現(xiàn)當(dāng)重組的PLD表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞進(jìn)入誘導(dǎo)階段時(shí)，在PLD的毒性作用下幾乎所有的重組細(xì)胞都被迅速殺死，活細(xì)胞數(shù)從109以上急劇減少至103，顯示出PLD極強(qiáng)的細(xì)胞毒性。張瑩在大腸桿菌表達(dá)鏈霉菌PLD時(shí)發(fā)現(xiàn)其對(duì)宿主的生長產(chǎn)生了明顯的毒害作用，影響了大腸桿菌BL21的生長速率，菌體濃度始終低于對(duì)照組。這表明PLD的過表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一定的毒害作用。

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NaCl脅迫對(duì)SaPLD過表達(dá)菌株生長和細(xì)胞形態(tài)的影響

PLD對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性與其引起細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)失衡及其磷脂代謝異常變化有關(guān)，而有學(xué)者認(rèn)為鹽脅迫作用可以緩解PLD對(duì)大腸桿菌的毒性，一定程度上可以抑制細(xì)胞發(fā)生裂解。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌進(jìn)行PLD表達(dá)時(shí)，NaCl脅迫作用下大腸桿菌的生物量有所增加，這表明NaCl脅迫作用為大腸桿菌提供了某種保護(hù)，有助于細(xì)胞抵抗PLD產(chǎn)生的毒性，因此選擇鈉離子對(duì)其進(jìn)行脅迫研究。首先考察了不同濃度的NaCl對(duì)細(xì)胞生長和油脂合成的影響。如圖7A所示，隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加，SaPLD過表達(dá)菌株的總油產(chǎn)量有了進(jìn)一步的提升，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為12 g/L時(shí)，總油產(chǎn)量達(dá)到最高值（30.5 g/L），相比野生型菌株和未脅迫培養(yǎng)過表達(dá)菌株分別提高了27.3%和17.6%。在NaCl的脅迫作用下，SaPLD過表達(dá)菌株生物量也有所恢復(fù)，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為12 g/L時(shí)，生物量恢復(fù)到了野生型裂殖壺菌的生長水平（圖7B），這說明NaCl脅迫作用確實(shí)可以緩解PLD對(duì)裂殖壺菌的細(xì)胞膜毒性。裂殖壺菌作為海洋真菌，始終生存在鹽度較高的環(huán)境下，PLD的表達(dá)可能打破了細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，而鈉離子可以維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓平衡和調(diào)節(jié)酸堿平衡，氯離子對(duì)嗜鹽菌株的生長有著至關(guān)重要的作用，因此添加一定量的NaCl可以起到緩解PLD的細(xì)胞毒性、促進(jìn)裂殖壺菌細(xì)胞生長的作用。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了在NaCl質(zhì)量濃度為12 g/L時(shí)突變株的生長代謝情況。如圖8A所示，脅迫培養(yǎng)菌株和未脅迫突變株在120 h前的生長趨勢基本一致，SaPLD-NaCl組的生物量一直略低于SaPLD組，而在120 h后SaPLDNaCl組生物量繼續(xù)增加，并在144 h超過SaPLD組，基本達(dá)到野生型菌株的生長水平；脅迫組的油脂產(chǎn)量也得到進(jìn)一步提高。由圖8B可知，在高濃度鹽脅迫下，SaPLD過表達(dá)菌株的葡萄糖消耗速率在24 h后比SaPLD組慢，48 h后和野生型的糖消耗量基本一致，這也是SaPLDNaCl組的生物量在120 h前一直低于SaPLD組的原因，可能是滲透壓的變化導(dǎo)致菌株細(xì)胞代謝發(fā)生了調(diào)整。72 h后SaPLD-NaCl組的糖消耗速率加快，在120 h時(shí)與其他2 組一樣糖基本消耗完，SaPLD-NaCl組的生物量最終與野生型菌株一致。由圖8C可知，野生型菌株的產(chǎn)油能力在72 h后基本趨于穩(wěn)定，而SaPLD過表達(dá)菌株產(chǎn)油能力在96 h后高于野生株。由圖8D可知，SaPLD過表達(dá)菌株的非油干基質(zhì)量濃度在72 h后低于野生型菌株。綜上，過表達(dá)細(xì)胞中更多代謝物用于油脂的合成，提高了單位細(xì)胞油脂的生產(chǎn)能力，且SaPLD-NaCl組的產(chǎn)油能力優(yōu)于SaPLD組，這可能是由于鹽脅迫改變了細(xì)胞膜的狀態(tài)，促進(jìn)了細(xì)胞的整體生長代謝，進(jìn)而提高了油脂合成。

由圖9可知，在鹽脅迫下過表達(dá)菌株的細(xì)胞皺縮破裂現(xiàn)象有了明顯緩解，細(xì)胞表面恢復(fù)光滑，形態(tài)飽滿，細(xì)胞形狀比未脅迫的SaPLD過表達(dá)菌株細(xì)胞更完整，尺寸也有所增加，基本和野生型形態(tài)一致。這表明NaCl脅迫培養(yǎng)可以改善SaPLD對(duì)細(xì)胞膜的毒害作用。從離子穩(wěn)態(tài)的角度來看，鹽脅迫下細(xì)胞需要重新平衡胞內(nèi)離子濃度以維持正常生理功能。在植物研究中，已有諸多證據(jù)表明PLD參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控過程。例如Zhang Ying等研究發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)PePLDδ的擬南芥通過增加編碼質(zhì)膜Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AtSOS1）和H+-ATPase（AtAHA2）基因的轉(zhuǎn)錄，使得轉(zhuǎn)基因植物能夠更好地進(jìn)行Na+外排并減少K+損失，維持細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)。并且，在鹽處理?xiàng)l件下抗氧化酶被激活，編碼超氧化物歧化酶、抗壞血酸過氧化物酶和過氧化物酶的基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，從而降低了電解質(zhì)泄漏量、丙二醛含量和H2O2水平，減輕氧化損傷。類似地，在裂殖壺菌中，鹽脅迫可能激活PLD相關(guān)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控通路。當(dāng)環(huán)境中的鹽濃度升高，裂殖壺菌可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上離子通道或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性與表達(dá)，促進(jìn)Na+排出細(xì)胞，減少胞內(nèi)Na+積累對(duì)細(xì)胞造成的毒性影響，同時(shí)維持K+等其他離子的正常濃度梯度，保障細(xì)胞內(nèi)酶活性和代謝反應(yīng)的正常進(jìn)行。不僅如此，鹽脅迫促使PLD參與激活抗氧化酶促系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶等。這些酶能夠協(xié)同作用，將細(xì)胞內(nèi)過多產(chǎn)生的活性氧，如超氧陰離子自由基、過氧化氫等轉(zhuǎn)化為無害的水和氧氣，降低活性氧對(duì)細(xì)胞大分子物質(zhì)，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的氧化損傷，進(jìn)而緩解PLD過表達(dá)可能帶來的細(xì)胞毒性。

綜上所述，鹽脅迫緩解PLD對(duì)裂殖壺菌細(xì)胞毒性的機(jī)制是多方面的，涉及離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、抗氧化防御系統(tǒng)激活等。未來研究可借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，深入分析鹽脅迫下裂殖壺菌細(xì)胞內(nèi)的分子變化，進(jìn)一步明確這些機(jī)制之間的相互關(guān)系與協(xié)同作用，為更好地理解和利用裂殖壺菌的生理特性提供理論依據(jù)。

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SAPLD過表達(dá)對(duì)二十碳五烯酸（EPA）和DHA合成的影響

由圖10可知，改造菌中EPA的合成較野生型均有明顯增加，且NaCl脅迫培養(yǎng)后，EPA的合成進(jìn)一步提高。DHA合成呈現(xiàn)出相反的變化，突變株中DHA的產(chǎn)量和單位細(xì)胞內(nèi)的含量均比野生型低，但脅迫培養(yǎng)的突變株還是略高于未脅迫培養(yǎng)的突變株。雖然EPA和DHA均是PUFAs，但卻出現(xiàn)了不同的變化，這可能是兩者的合成途徑不同，需要進(jìn)一步的分析研究。

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SaPLD過表達(dá)對(duì)總油脂中脂肪酸組成的影響

如表1所示，在搖瓶發(fā)酵過程中SaPLD過表達(dá)對(duì)脂肪酸組成成分產(chǎn)生了明顯影響，其中SFAs相對(duì)含量提高（主要體現(xiàn)在C16:0的增加），PUFAs相對(duì)含量下降。與野生型菌株相比，在144 h時(shí)突變菌株的SFAs相對(duì)含量極顯著提高（P＜0.01），PUFAs和DHA相對(duì)含量均極顯著降低（P＜0.01），這說明SaPLD過表達(dá)不利于PUFAs的積累，尤其是DHA的合成。PUFAs的減少會(huì)對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利的影響，從而影響裂殖壺菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的利用，進(jìn)而影響了細(xì)胞生長。但EPA呈現(xiàn)了相反的變化，SaPLD過表達(dá)增加了脂肪酸中EPA的占比，在144 h時(shí)EPA占比比野生型菌株提高了35.7%，圖10也顯示SaPLD過表達(dá)菌株的EPA產(chǎn)量和單位細(xì)胞內(nèi)含量分別比野生型提高了約43%和約70%，進(jìn)一步說明SaPLD過表達(dá)有利于EPA的合成。

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SaPLD過表達(dá)對(duì)磷脂代謝的影響

7.1 SaPLD過表達(dá)對(duì)磷脂合成的影響

如圖11所示，SaPLD過表達(dá)后使得細(xì)胞磷脂整體合成減弱，TAG合成增強(qiáng)。3 株菌中TAG的相對(duì)含量在脂質(zhì)轉(zhuǎn)化期（120 h）均比脂質(zhì)合成期（72 h）高，而磷脂相對(duì)含量則降低，表明裂殖壺菌在后期會(huì)將磷脂轉(zhuǎn)化為TAG，從而提高TAG的產(chǎn)量。此外，在鹽脅迫條件下突變株的磷脂通路在前期（72 h）會(huì)比未脅迫時(shí)略有恢復(fù)，這說明鹽脅迫可能通過調(diào)控磷脂代謝改變細(xì)胞膜狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長。

7.2 SaPLD過表達(dá)對(duì)磷脂中脂肪酸組成的影響

由表2可知，無論是在野生型還是過表達(dá)菌株中，TAG中SFAs含量最高，接近50%～60%，其中C16:0占比最高，接近SFAs的90%以上；大部分的DHA、DPA和EPA占總PUFAs含量的90%以上，表明PUFAs主要貯存在TAG中；從發(fā)酵時(shí)間來看，所有菌株在發(fā)酵后期的TAG中EPA和DHA含量均有增加，相應(yīng)地SFAs出現(xiàn)了下降，表明發(fā)酵后期更多的PUFAs遷移積累在TAG中；從不同菌株來看，SaPLD過表達(dá)明顯降低了發(fā)酵過程TAG中的DHA含量，相對(duì)地提高了SFAs含量和EPA含量，這說明SaPLD過表達(dá)抑制了TAG中DHA的結(jié)合，促進(jìn)了SFAs和EPA的結(jié)合，也表明EPA和DHA的合成途徑存在差異，EPA可能更多地與SFAs的合成途徑有關(guān)。

磷脂中SFAs含量也接近40%～50%，但其中C 16:0 占比低于TAG，而C 18:0 占比明顯提高，說明C 18:0 更偏向結(jié)合在磷脂中；磷脂中結(jié)合的其他脂肪酸接近30%～40%，而PUFAs僅占10%～15%，其中基本不含EPA，說明PUFAs主要結(jié)合在TAG中；從發(fā)酵時(shí)間來看，在120 h時(shí)所有菌株磷脂中DHA含量均低于72 h時(shí)，結(jié)合TAG中后期DHA含量的增加，推測后期DHA從磷脂向TAG中遷移貯存；而過表達(dá)菌株磷脂中SFAs含量和其他脂肪酸則呈現(xiàn)與野生型菌株不同的變化，后期磷脂中SFAs含量略微增加，PUFAs含量只有略微降低，表明SaPLD的過表達(dá)抑制了PUFAs從磷脂向TAG中的遷移，最終減少了DHA的積累；從不同菌株來看，對(duì)比野生型，過表達(dá)SaPLD在72 h時(shí)同時(shí)降低了磷脂中SFAs和DHA的占比，而在120 h同時(shí)提高了二者的占比，但前期對(duì)DHA的影響更為明顯，后期對(duì)SFAs的影響更為明顯，這說明SaPLD表達(dá)在前期抑制了磷脂結(jié)合脂肪酸的能力，主要抑制DHA的結(jié)合能力，在后期有利于脂肪酸結(jié)合到磷脂上，主要促進(jìn)SFAs的結(jié)合。

另外，相比于未脅迫培養(yǎng)，鹽脅迫培養(yǎng)并未對(duì)突變株中各脂肪酸含量有明顯影響，進(jìn)一步說明鹽脅迫對(duì)脂肪酸的主要合成途徑并未產(chǎn)生影響，主要是保護(hù)了細(xì)胞膜的形態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞生長。值得注意的是，EPA主要結(jié)合在TAG中，在磷脂中只檢測到了極其微量的EPA，表明EPA的積累更多地與TAG合成通路有關(guān)，與磷脂代謝相關(guān)性不大，這為開展裂殖壺菌產(chǎn)EPA的研究提供了新的視角。

7.3 SaPLD過表達(dá)對(duì)磷脂類型的影響

如圖12所示，裂殖壺菌中磷脂種類豐富，野生型菌株與SaPLD過表達(dá)菌株中都檢測出PC、PG、PI、PE、LPC、PS和PA這7大類磷脂，占比最高的主要為PC、PG和PI，其中PC含量占磷脂總量的一半左右。Wang Guang等也發(fā)現(xiàn)在裂殖壺菌中PC是主要的極性脂質(zhì)。此外，菌株磷脂種類占比在發(fā)酵的不同時(shí)期均出現(xiàn)了變化，表明在對(duì)數(shù)生長期（72 h）和脂質(zhì)轉(zhuǎn)化期（120 h）磷脂的代謝會(huì)發(fā)生變化。

對(duì)于野生菌株而言，除了PG在120 h時(shí)明顯降低之外，其他磷脂均有不同程度的增加。PG與細(xì)胞的生長狀況有著密切的聯(lián)系，在對(duì)數(shù)生長期發(fā)酵液中碳源充足，且葡萄糖轉(zhuǎn)換為甘油比轉(zhuǎn)化為其他磷脂極性頭部基團(tuán)要容易的多，所以在碳源充足的情況下合成PG可能更容易滿足細(xì)胞指數(shù)生產(chǎn)期間的膜磷脂供應(yīng)；在脂質(zhì)轉(zhuǎn)化期，葡萄糖消耗殆盡，細(xì)胞停止增殖，膜磷脂代謝從磷脂合成轉(zhuǎn)向磷脂間的相互轉(zhuǎn)化，PG合成降低，這又會(huì)影響細(xì)胞應(yīng)激感應(yīng)和適應(yīng)機(jī)制的脂質(zhì)依賴性。PI占比的增加可能是因?yàn)榧?xì)胞中脂質(zhì)代謝活躍，PI作為信號(hào)分子加強(qiáng)了相關(guān)代謝的調(diào)控。LPC占比的增加可能是因?yàn)榧?xì)胞生長后期開始破裂，導(dǎo)致LPC的增加，這與Moog等發(fā)現(xiàn)LPC含量的增加會(huì)使細(xì)胞膜發(fā)生破裂，影響細(xì)胞生長的結(jié)果一致。該研究表明PE、PS和PA占比雖然很少，但它們組成的變化在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能中也發(fā)揮著重要作用。

對(duì)比野生型和過表達(dá)菌株的磷脂組成，在72 h時(shí)過表達(dá)菌株中PG和PC含量明顯降低，而PI、LPC和PA均有一定程度的增加，PS和PE無明顯變化。PLD能夠催化水解反應(yīng)和轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)，一方面SaPLD的過表達(dá)催化底物PC和PG發(fā)生水解反應(yīng)，使二者含量降低，導(dǎo)致過表達(dá)菌株細(xì)胞生長開始低于野生型，而PC和PG的水解使得產(chǎn)物PA含量增加，PA經(jīng)Kennedy途徑合成TAG，這也是SaPLD過表達(dá)菌株油脂產(chǎn)量增加的原因之一；另一方面PLD的轉(zhuǎn)磷脂酰活性使得不同磷脂之間發(fā)生了轉(zhuǎn)換，PG轉(zhuǎn)化為信號(hào)作用更強(qiáng)的PI進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)和脂質(zhì)調(diào)控。在發(fā)酵120 h時(shí)，過表達(dá)菌株中LPC和PA占比明顯提高。LPC的增加可能是因?yàn)镾aPLD過表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性，從而使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。PA的增加進(jìn)一步說明有更多的磷脂發(fā)生水解，進(jìn)而對(duì)應(yīng)于PI和PG含量減少，從而增強(qiáng)了Kennedy途徑代謝流，促進(jìn)磷脂向TAG的轉(zhuǎn)變。

對(duì)于過表達(dá)菌株而言，鹽脅迫培養(yǎng)沒有明顯改變相同時(shí)間段下細(xì)胞的磷脂組成，這表明鹽脅迫抵抗PLD的細(xì)胞毒性并非通過改變磷脂成分，而有可能是改變了胞內(nèi)外的離子代謝流，從而調(diào)控了細(xì)胞膜功能，維護(hù)了細(xì)胞形態(tài)的完整性，這與2.7.2節(jié)的結(jié)論相印證。

7.4 SaPLD過表達(dá)對(duì)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

脂肪酸合成的第1步是通過乙酰輔酶A羧化酶（ACC）將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，為脂肪酸和油脂積累提供前體物。如圖13A所示，SaPLD的過表達(dá)使ACC轉(zhuǎn)錄水平在前期提高，而在發(fā)酵的中后期降低，結(jié)合圖5A可知SaPLD過表達(dá)后使菌株在前期把更多的葡萄糖轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)合成前體丙二酰輔酶A，從而促進(jìn)中后期油脂的合成。Li Jing等發(fā)現(xiàn)在氮缺陷條件下Nannochloropsis中ACC的表達(dá)后期降低，但總脂質(zhì)含量顯著增加。鏈長因子（CLF）作為PKS基因簇上的延長因子，調(diào)控著超長鏈PUFAs的合成，現(xiàn)已證實(shí)PKS和FAS途徑分別負(fù)責(zé)裂殖壺菌中DHA和SFAs的合成，故對(duì)脂肪酸合成途徑相關(guān)的FAS和CLF進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析。如圖13B、C所示，SaPLD的過表達(dá)使菌株細(xì)胞中FAS基因轉(zhuǎn)錄水平上升，而CLF基因轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了下調(diào)，這與油脂中脂肪酸占比變化相印證（表1），SFAs含量增加，而DHA占比減少。磷脂酸磷酸酶（PAP）催化PA合成DAG，再由DGAT催化合成TAG。如圖13D、E所示，過表達(dá)菌株中PAP和DGAT的轉(zhuǎn)錄水平均高于野生型，這說明SaPLD過表達(dá)使裂殖壺菌中Kennedy途徑增強(qiáng)，產(chǎn)生更多的PA（圖12）和DAG去合成TAG，最終提高油脂產(chǎn)量（圖5）。PDAT和PDCT兩種酶均可作用于PC將其分別轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)為TAG和DAG。Lu Chaofu等在擬南芥突變種子中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PDCT突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致DAG中的PUFAs含量顯著降低。由圖13F、G可知，在裂殖壺菌中過表達(dá)SaPLD使PDAT的轉(zhuǎn)錄水平降低，而PDCT的表達(dá)水平先增加后降低，這表明SaPLD的過表達(dá)削弱了PC通過PDAT催化直接將脂酰基轉(zhuǎn)移至DAG形成TAG的通路，相應(yīng)強(qiáng)化了水解其他磷脂生成PA和將PC經(jīng)PDCT作用轉(zhuǎn)化為DAG的通路，DAG再經(jīng)DGAT催化合成TAG，最終使得TAG含量增加。

7.5 SaPLD過表達(dá)調(diào)控裂殖壺菌油脂代謝的機(jī)制分析

SaPLD過表達(dá)后使裂殖壺菌細(xì)胞生長和油脂代謝都發(fā)生了變化，其對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)控機(jī)制如圖14所示。過表達(dá)的SaPLD更多地發(fā)揮水解作用，使得總磷脂含量降低，其中主要催化磷脂PC發(fā)生水解反應(yīng)，使PC轉(zhuǎn)化為PA，促進(jìn)了PA經(jīng)Kennedy途徑形成DAG進(jìn)而轉(zhuǎn)化為TAG，最終使總油含量提高。由于PC的水解，使得主要通過結(jié)合PC再轉(zhuǎn)移至TAG的DHA減少，游離的DHA會(huì)反饋抑制合成PUFAs的PKS通路，相應(yīng)促進(jìn)了合成SFAs的FAS通路，最終使得與PKS通路相關(guān)的DHA合成降低，與FAS通路相關(guān)的EPA合成增加。Liu Jin等在利用微擬球藻提升EPA產(chǎn)量的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的代謝流會(huì)發(fā)生改變，使得參與SFAs合成的相關(guān)物質(zhì)和能量供應(yīng)也相應(yīng)增加，以滿足整體脂肪酸合成網(wǎng)絡(luò)的需求，體現(xiàn)出EPA合成與SFAs合成之間存在正向關(guān)聯(lián)。對(duì)脂肪酸合成途徑的干預(yù)并非孤立地影響某一種脂肪酸的合成，而是對(duì)整個(gè)脂肪酸代謝網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生系統(tǒng)性影響。這進(jìn)一步支持了本研究的結(jié)論，即SaPLD過表達(dá)引發(fā)的代謝變化并非單一途徑的改變，而是涉及多個(gè)脂肪酸合成途徑之間的相互作用。當(dāng)PKS通路受游離DHA反饋抑制而影響DHA合成時(shí)，與之相關(guān)聯(lián)的FAS通路被促進(jìn)，使得EPA合成增加的同時(shí)，SFAs合成途徑也可能因整體代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)整而受到正向影響，最終表現(xiàn)出EPA與SFAs合成途徑呈正相關(guān)。

8

結(jié) 論

本研究通過對(duì)裂殖壺菌中異源過表達(dá)SaPLD的深入探究，系統(tǒng)揭示了PLD在調(diào)控細(xì)胞生長與油脂代謝過程中的復(fù)雜機(jī)制。SaPLD通過水解PC和PG，增強(qiáng)PA生成，激活Kennedy途徑，最終實(shí)現(xiàn)油脂合成的上調(diào)。盡管SaPLD過表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長具有一定毒性，但通過鹽脅迫手段可有效緩解其負(fù)面影響，并進(jìn)一步提升油脂產(chǎn)量。在脂肪酸代謝方面，SaPLD的引入改變了裂殖壺菌脂肪酸合成偏好，在降低DHA合成的同時(shí)，大幅促進(jìn)了EPA的積累，這為裂殖壺菌作為EPA生產(chǎn)平臺(tái)的開發(fā)提供了新方向。本研究不僅深化了對(duì)裂殖壺菌磷脂代謝與油脂合成調(diào)控機(jī)制的理解，更為工業(yè)菌株改造提供了重要的理論依據(jù)和技術(shù)策略。未來研究可在此基礎(chǔ)上，深入解析SaPLD水解活性調(diào)控的分子機(jī)制，通過蛋白質(zhì)工程手段對(duì)SaPLD進(jìn)行定向改造，增強(qiáng)其在裂殖壺菌中的催化特異性與穩(wěn)定性，減少對(duì)細(xì)胞生長的負(fù)面影響，為實(shí)現(xiàn)裂殖壺菌高效合成特定脂肪酸、滿足食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的需求奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

作者簡介

第一作者：

童俊，廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院2024級(jí)碩士研究生，研究方向主要為功能油脂的微生物合成。

通信作者：

凌雪萍，廈門大學(xué)化工學(xué)院副教授，博士，研究領(lǐng)域：微生物代謝工程、酶工程與益生菌發(fā)酵工藝開發(fā)；先后主持和參與國家級(jí)、省部級(jí)等項(xiàng)目20余項(xiàng)，企業(yè)合作與開發(fā)項(xiàng)目15余項(xiàng)；發(fā)表國內(nèi)外學(xué)術(shù)論文50余篇，獲得國內(nèi)外授權(quán)專利20余項(xiàng)。在微生物合成多不飽和脂肪酸領(lǐng)域研究多年，完成了從菌種進(jìn)化改造、合成培養(yǎng)基及流加培養(yǎng)工藝優(yōu)化、小試、中試到工業(yè)化生產(chǎn)的成套發(fā)酵和油脂提取、精制、包埋等集成化技術(shù)和工藝。其中DHA生產(chǎn)主要技術(shù)指標(biāo)遠(yuǎn)超同類行業(yè)水平，已在廈門匯盛生物有限公司、廈門金達(dá)威集團(tuán)等多家企業(yè)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，促進(jìn)了相關(guān)行業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展與產(chǎn)業(yè)布局。

引文格式：

童俊, 陸濤, 盧英華, 等. 異源表達(dá)磷脂酶D調(diào)控裂殖壺菌磷脂代謝對(duì)脂質(zhì)合成的影響[J]. 食品科學(xué), 2025, 46(22): 213-226. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250508-034.

TONG Jun, LU Tao, LU Yinghua, et al. Effect of heterologous expression of phospholipase D on lipid synthesis by regulating phospholipid metabolism in Schizochytrium sp.[J]. Food Science, 2025, 46(22): 213-226. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250508-034.

實(shí)習(xí)編輯：楊倩；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

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