撰文 |章臺柳

CAR-T細(xì)胞是目前治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的極具前景的方法，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn) 7 種CAR - T細(xì)胞療法。但標(biāo)準(zhǔn)CAR-T制作流程復(fù)雜，涉及從患者外周血中分離和富集T細(xì)胞、T細(xì)胞活化、使用病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染CAR基因、體外CAR-T細(xì)胞擴增、CAR-T細(xì)胞質(zhì)控、冷凍保存以及回輸，整個制造周期一般需要2 -4 周，具有產(chǎn)品質(zhì)量不均一、生產(chǎn)周期長、成本高昂等缺點。CAR通常需要逆轉(zhuǎn)錄病毒載體遞送，并隨機整合到基因組，會產(chǎn)生表達的異質(zhì)性。利用CRISPR - Cas 9 和AAV介導(dǎo)的同源定向修復(fù)（HDR），將CAR整合至內(nèi)源性 人TCRα恒定區(qū) （ TRAC ）基因位點，這種 TRAC 整合型CAR - T細(xì)胞可呈現(xiàn)動態(tài)CAR表達模式，延緩T細(xì)胞耗竭，并在異種移植與免疫缺陷模型中改善腫瘤控制效果。這也為開發(fā)同種異體CAR-T細(xì)胞療法奠定了關(guān)鍵基礎(chǔ)：CAR插入后會破壞內(nèi)源性TCR，可預(yù)防移植物抗宿主病。目前，使用健康供體或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）來源的同種異體TRAC - CAR-T細(xì)胞的臨床試驗中，已在淋巴細(xì)胞預(yù)清除的血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者中獲得完全緩解。同種異體療法可通過使用健康供體來源的“off - the - shelf”產(chǎn)品，解決生產(chǎn)限制問題；然而，同種異體CAR-T細(xì)胞最終仍會被宿主排斥，且頻繁出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)。

體內(nèi)直接生成 CAR-T 細(xì)胞有望克服白血病相關(guān)的體外制備瓶頸，同時還能促進分化程度更低的 CAR-T 細(xì)胞生成，這類細(xì)胞與改善的體內(nèi)抗腫瘤活性相關(guān)。迄今為止，為在體內(nèi)生成 CAR-T 細(xì)胞，研究者已嘗試使用隨機整合病毒載體（組成型CAR表達）或非病毒載體（ LNPs ，導(dǎo)致瞬時 CAR 表達），兩種方法均在非人靈長類動物和人體中得到驗證，且近期已進入 I 期臨床試驗。然而，這些方法面臨諸多挑戰(zhàn)，包括治療劑量下的編輯效率不足、脫靶效應(yīng)風(fēng)險；同時， CAR 的遞送與表達需具備 T 細(xì)胞特異性，否則向造血干細(xì)胞（ HSC ）的脫靶編輯可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化性突變，而CAR在腫瘤細(xì)胞中表達則可能阻礙CAR靶標(biāo)在細(xì)胞表面的呈現(xiàn)，進而引發(fā)抗原陰性復(fù)發(fā)。采用LNPs遞送 CAR mRNA 可實現(xiàn)瞬時 CAR 表達，這避免了插入突變或 CAR 在腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定表達的風(fēng)險，但其所需劑量尚不明確。慢病毒載體的包膜可經(jīng)工程化改造以提高對 T 細(xì)胞的特異性，但任何被轉(zhuǎn)導(dǎo)的非 T 細(xì)胞同樣會表達 CAR （除非使用譜系特異性啟動子），并且盡管罕見，仍存在插入突變的潛在風(fēng)險。那么假設(shè)，在體內(nèi)將無啟動子的 CAR 轉(zhuǎn)基因整合至 TRAC 位點，可以實現(xiàn) T 細(xì)胞特異性且生理性的 CAR 表達，同時繞過體外細(xì)胞制備的環(huán)節(jié)。但迄今為止，在人體 T 細(xì)胞中實現(xiàn)大片段 DNA 的體內(nèi)定點整合仍難以實現(xiàn)。

近日 ，來自 UCSF的 Justin Eyquem 團隊 在 Nature 雜 志上發(fā)表文章 In vivo site-specific engineering to reprogram T cells ，展示了通過體內(nèi)定點整合大片段DNA，可以實現(xiàn)穩(wěn)定且細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)基因表達。開發(fā)了一個雙載體系統(tǒng)：分別使用包膜遞送載體（EDV）遞送CRISPR–Cas9核糖核蛋白（RNP），使用腺相關(guān)病毒（AAV）遞送DNA供體模板。對兩種載體進行優(yōu)化，以提高其對T細(xì)胞的特異性遞送和基因打靶效率。通過將CAR轉(zhuǎn)基因整合到T細(xì)胞特異性位點（TRAC），在B細(xì)胞再生障礙、血液系統(tǒng)惡性腫瘤及實體瘤的人源化小鼠模型中，體內(nèi)生成了達到治療水平的CAR-T細(xì)胞。 這些發(fā)現(xiàn)為實現(xiàn)更高效、更精準(zhǔn)且更可及的T細(xì)胞療法開辟了新路徑。

體內(nèi)定點整合需要遞送Cas 9 和同源定向修復(fù)模版。之前的研究顯示，工程化包膜遞送載體（EDVs）可利用抗體-抗原相互作用，在體內(nèi)將Cas9核糖核蛋白復(fù)合物瞬時且選擇性地遞送至目標(biāo)細(xì)胞，但在體內(nèi)實現(xiàn)大片段同源定向修復(fù)模板的核內(nèi)遞送仍是一項挑戰(zhàn)。AAV6被報道可在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)人T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和造血干細(xì)胞。研究人員計劃用其來遞送同源定向修復(fù)模板，該模板編碼一種無啟動子的CD 19 CAR cDNA，其兩側(cè)側(cè)翼為自裂解2A肽和截短的表皮生長因子受體。這種設(shè)計使得CAR在整合后能夠由內(nèi)源性 TRAC 啟動子驅(qū)動表達，該啟動子具有T細(xì)胞特異性。為了生成 TRAC -CAR T細(xì)胞，研究人員將靶向 TRAC 的Cas9-EDVs與包裝在AAV6中的 TRAC -CD19 CAR同源定向修復(fù)模板聯(lián)合使用。首先在體外評估遞送效率。EDVs遞送Cas 9- sgRNA的效率較高，即使在最低感染復(fù)數(shù)下，僅使用EDVs就能實現(xiàn)5 0% 的TCR敲除，證實了先前報道的有效性。將靶向 TRAC 的Cas9-EDVs與遞送同源定向修復(fù)模版的AAV6聯(lián)合用于原代T細(xì)胞，出現(xiàn)CAR+TCR - 群體，比例約3 9.2% ，表明成功在體外實現(xiàn) TRAC CAR - T細(xì)胞的生成。隨后向NSG小鼠移植人PBMCs構(gòu)建人源化小鼠，靜脈注射相關(guān)EDVs和AAV 6 ，結(jié)果顯示小鼠脾臟中約3 % 的T細(xì)胞為 TRAC CAR - T細(xì)胞，且B細(xì)胞再生出現(xiàn)障礙，證明體內(nèi)生成的靶向CD 19 的 TRAC CAR - T具有功能性。由于MHC - I / II完整的NSG小鼠在移植了人PBMCs后會誘導(dǎo)移植物抗宿主病，進而會激活T細(xì)胞，猜測會因此提高敲入效率。MHC - I / II雙敲的NSG小鼠對異種移植物抗宿主病具有抵抗，則未檢測到 TRAC CAR - T，也沒有B細(xì)胞再生障礙。即在MHC完整的NSG小鼠中，異種移植物抗宿主病是VSVG-EDV和AAV6介導(dǎo)的敲入所必需的。

雖然在體內(nèi)生成了 TRAC CAR - T，但效率低下，可能的原因有：(1) AAV對血清中和抗體的敏感性；(2) 缺乏對T淋巴細(xì)胞的選擇性；(3) 處于增殖狀態(tài)的T細(xì)胞數(shù)量有限。為了解決AAV對中和抗體敏感的問題，對AAV 6 衣殼文庫進行進化。在有人類血清存在的條件下，將人T細(xì)胞與衣殼文庫以低感染復(fù)數(shù)共培養(yǎng)。隨后洗滌T細(xì)胞，純化細(xì)胞內(nèi)病毒DNA，并將其克隆到野生型AAV質(zhì)粒骨架中，以生成用于下一輪進化的衣殼文庫。經(jīng)過三輪感染循環(huán)后，利用二代測序?qū)τH代文庫和進化后的文庫進行分析，鑒定出多個優(yōu)勢變體，其中一種攜帶氨基酸基序HAPRVEE的變體，其豐度相較于親代文庫富集了約20,000倍。評估進化后的AAV在T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，結(jié)果顯示在血清存在的條件下，AAV 6 在較低感染復(fù)數(shù)時遞送效率受損，而進化后AAV的遞送效率沒有改變，表明對預(yù)先存在的中和抗體具有抗性，且生成的 TRAC CAR - T對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力沒有差異。為了確定調(diào)控新進化的AAV變體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的宿主因子，對T細(xì)胞進行全基因組CRISPR敲除篩選。結(jié)果顯示，CD 7 ，一種在T細(xì)胞和NK細(xì)胞上表達的跨膜受體，是T細(xì)胞進化型AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的最關(guān)鍵決定因素。敲除CD 7 顯著降低進化變體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而對AAV 6 沒有影響。將這種在人T細(xì)胞上進化且靶向CD7的變體稱為AAV-hT7。

第二個障礙是在遞送層面缺乏T細(xì)胞特異性。為了進一步提高EDV/AAV遞送系統(tǒng)的選擇性，研究人員通過引入一種與LDLR受體家族親和力消除的突變型VSVG，并添加了能夠同時實現(xiàn)靶向和激活作用的抗CD3單鏈可變片段，來限制EDV的特異性。評估其對細(xì)胞類型的偏好性，發(fā)現(xiàn)VSVG / AAV 6 在所有測試的細(xì)胞譜系中都實現(xiàn)基因編輯；而AAV-hT 7+ anti - CD 3- EDV的組合將基因編輯限制在CD 4+ 和CD 8+ T細(xì)胞中。

第三個障礙是處于增殖狀態(tài)的T細(xì)胞數(shù)量有限。研究人員檢測anti - CD 3- EDV是否能誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，結(jié)果顯示活化標(biāo)志物CD 25 和CD 69 的表達顯著增加，與使用1:10的磁珠與細(xì)胞比例的抗CD3/抗CD28 Dynabeads處理的效果相當(dāng)。即進化的AAV衣殼和抗CD3-EDV共同解決了體內(nèi)遞送所面臨的三個既定挑戰(zhàn)。

在體內(nèi)評估 TRAC CAR - T生成效率，結(jié)果顯示anti - CD 3- EDV + AAV-hT7的組合誘導(dǎo)的CAR T細(xì)胞數(shù)量顯著增多，且CAR整合率最高可達脾臟中所有T細(xì)胞的1 9.7% ，且未檢測到系統(tǒng)性炎癥或細(xì)胞因子風(fēng)暴。對體內(nèi)生成的 TRAC - CAR T細(xì)胞的特征進行分析，未處理小鼠與CAR陰性T細(xì)胞之間沒有差異。在 TRAC -CAR T 細(xì)胞群體中，同時存在CD4 + 和CD8+ T 細(xì)胞，且CD4與CD8的比例平衡。此外，Ki -67 的表達更高，存在大量TOX + 群體。這都表明，在體內(nèi)生成了一種高增殖能力的CAR T細(xì)胞群體，該群體保留了記憶標(biāo)志物，且Treg比例顯著降低。

最后，研究人員評估了體內(nèi)生成的 TRAC CAR - T對B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病（B-ALL）、多發(fā)性骨髓瘤和肉瘤的抗腫瘤效果。NSG - MHC -1/ II雙敲除小鼠接種侵襲性NALM 6 白血病細(xì)胞系，3天后注射人PBMC，1天后注射anti - CD 3- EDV + AAV-hT7。單次注射后，來自四個人PBMC供體的20只小鼠中有18只達到了完全緩解。為了與傳統(tǒng)CAR - T直接進行抗腫瘤效果的比較，使用同一個人PBMC作為供體，比較體外慢病毒感染產(chǎn)生的CAR - T或慢病毒感染產(chǎn)生的 TRAC CAR - T、anti - CD 3- EDV + AAV-hT7以及慢病毒遞送產(chǎn)生的體內(nèi)CAR - T的治療效果。結(jié)果顯示，接受anti - CD 3- EDV + AAV-hT7治療的小鼠全部實現(xiàn)完全的腫瘤控制，優(yōu)于其他處理組。而且，anti - CD 3- EDV + AAV-hT7誘導(dǎo)產(chǎn)生的 TRAC CAR - T顯示出更高頻率的 CD45RA+ CD62L + CD8 + 亞群，這表明其具有幼稚或干細(xì)胞記憶表型。所有 TRAC CAR - T細(xì)胞均顯示出高且均一的CAR表達，反映了由 TRAC 位點特異性整合賦予的均一轉(zhuǎn)錄調(diào)控。將NSG-MHC-I/II雙敲除小鼠植入多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系OPM2，然后注射PBMC并進行anti - CD 3- EDV + AAV-hT7（ TRAC - BCMA-CAR）治療。所有接受治療的小鼠（8/8）均達到了完全緩解。腫瘤細(xì)胞再次攻擊后，4只緩解的小鼠中有3只保持了持久的腫瘤控制，表明體內(nèi)生成的CAR-T細(xì)胞具有持久性。將NSG-MHC-I/II雙敲除小鼠植入MES - SA肉瘤，然后注射PBMC并進行anti - CD 3- EDV + AAV-hT7（ TRAC - B 7 H 3 -CAR）治療。在一個供體的6只小鼠中的5只中引發(fā)了完全緩解，并在第二個供體的8只小鼠中的3只中引發(fā)了完全緩解。這些結(jié)果證明了anti - CD 3- EDV + AAV-hT7治療在血液系統(tǒng)惡性腫瘤之外的應(yīng)用。即這些數(shù)據(jù)表明使用雙重優(yōu)化的AAV和EDV可進行體內(nèi)定點CAR T細(xì)胞生成，體內(nèi)重編程T細(xì)胞可針對多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤和一種實體瘤模型產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞治療反應(yīng)，將體內(nèi) TRAC -CAR T 胞生成確立為一個極具前景的治療平臺。

總的來說，研究開發(fā)了高效且特異的體內(nèi)CAR-T生成新方法，且在血液腫瘤和實體瘤中都顯示出良好的腫瘤控制能力。

https://www.nature.com/articles/s41586-026-10235-x

制版人：十一

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