Nat Chem Biol | 張凱銘/李珊珊團隊揭示魚腥藻內含子無損環化機制并提升環化效率

I 類內含子（Group I introns）作為最早發現的催化RNA之一，其自剪接與環化能力不僅是生命起源研究的重要線索，也構成了環狀RNA（circRNAs）體外合成的重要基礎。然而，包含完整外顯子序列的全長核酶結構及其自剪接與環化過程的動態調控機制仍有待進一步闡明。

2026年4月14日，中國科學技術大學生醫部張凱銘/李珊珊團隊在Nature Chemical Biology期刊上發表題為Self-splicing and cyclization mechanisms of the full-lengthAnabaenapre-tRNA的研究論文, 利用單顆粒冷凍電鏡技術捕捉了藍細菌魚腥藻（Anabaenasp. PCC 7120）tRNA(Leu) 前體在自剪接與環化過程中的多個關鍵構象狀態，系統揭示了其結構動態機制，并在此基礎上實現了環化效率的結構指導優化。

多狀態結構解析：捕捉RNA催化全過程

研究團隊通過調控反應條件減緩自剪接過程，并結合硫代磷酸修飾策略，成功捕捉到Anabaena pre-tRNA在不同反應階段的構象狀態，包括Apo、Pre-1S、Pre-2S、線性內含子和環狀內含子等多個關鍵中間體（圖1）。結構分析顯示，在Apo狀態中，盡管P1螺旋尚未形成，tRNA外顯子已預先折疊為成熟的“L”形結構，為后續剪接反應提供了結構基礎。這一結果揭示了外顯子結構在剪接啟動中的關鍵作用。

圖1: 全長 Anabaena tRNA(Leu) 前體自剪接與環化的多狀態冷凍電鏡結構。a. Anabaena tRNA(Leu) 前體催化過程示意圖，包括自折疊、自剪接及內含子環化。b. 反應過程中涉及的化學官能團。c. tRNA(Leu) 前體二級結構示意。d-g. tRNA(Leu) 前體的冷凍電鏡重構結構。

剪接啟動：大尺度結構重排驅動催化

從Apo到Pre-1S狀態，RNA發生顯著構象變化：tRNA結構域發生了約18 ?的平移與180°的旋轉，P1/P1ext螺旋形成，P2螺旋發生約8 ?位移，J9.0/AC-arm從69°擴展至144°，為P1螺旋進入活性中心讓出空間。與此同時，G結合口袋（G binding site）與J8/7區域重排，形成了可以容納外源鳥苷（exoG）的催化環境。值得注意的是，此時exoG雖已結合，其O3'與剪接位點距離接近，但攻擊角度尚未達到催化要求，表明Pre-1S狀態為一個“預反應”構象，需要進一步微調才能啟動第一步剪接反應。

無損環化機制：同一活性位點再利用

與Tetrahymena、Azoarcus、T4 td等I類內含子在環化過程中會丟失若干5' 末端核苷酸不同，Anabaena內含子可在不丟失任何序列的情況下形成完整環狀RNA。通過RNase R消化、測序與電泳遷移率分析，研究團隊證實了其形成的環狀內含子為共價閉合、無額外殘基插入的完整環狀RNA。線性與環化內含子的結構比對顯示，兩者整體構象高度相似，表明G結合位點被再次用于環化反應，即ωG的3'-OH發起第三次親核攻擊完成環化。這一發現揭示了核酶通過“復用”同一催化中心實現不同反應步驟的機制，為理解RNA催化的靈活性提供了新的結構依據。

關鍵位點G37：調控環化效率的分子開關

研究團隊進一步發現，位于J2/3區域的G37在環化過程中發生了顯著的構象翻轉，通過堿基堆積穩定P1延伸結構，從而精準定位環化位點。與此同時，保守的A1–U8堿基對及其與wobble受體基序（A57/A84）的相互作用共同參與環化位點的確定。基于這一結構機制，研究團隊對G37進行單點突變（G37U、G37C），在三種不同的環化體系中均顯著提高了環化效率。在與最新TRIC-V2方法的對比中，結構優化后的Anabaena PIE系統在最終產率上表現出更高優勢。

金屬離子動態重排：催化過程的精細調控

作為經典金屬酶，I類內含子活性依賴于多個金屬離子（MA、MB/C、ME）的精準定位。本研究發現，在不同反應階段，MA、MB/C、ME等金屬離子在活性中心附近發生動態重排：從Apo狀態下遠離活性位點，到線性內含子中逐漸接近并參與配位，再到環化后重新調整位置。這些變化反映了催化過程中金屬離子對反應空間構型的精細調控，進一步揭示了RNA催化的分子基礎。

從機制到應用：推動環狀RNA技術發展

本研究不僅揭示了AnabaenaI類內含子自剪接與環化的結構動態機制，還首次得到了全長內含子序列環化的結構基礎，并基于G37及其PIE系統的等位突變實現了環化效率的結構指導性優化。這些成果不僅加深了對RNA催化機制的理解，也為環狀RNA的體外合成、RNA藥物開發及相關生物技術應用提供了新的結構設計思路。

同時，該工作受邀配發Research Briefing（“Structural snapshots of self-splicing and circularization of the Anabaena precursor tRNA”），對研究的核心發現進行進一步解讀。該研究也是團隊在核酶結構與機制研究方向上的又一重要進展（Nature 2021; PNAS 2022; Nucleic Acids Research 2023; Nature Communications 2023; Nature 2025；Nature Catalysis 2025；Nature Communications 2026）。

中國科學技術大學生醫部博士研究生張曉靜為本文的第一作者，博士生安林鳳、伊然、劉霽和博士后楊雯在本研究中做出了重要貢獻，李珊珊副教授和張凱銘教授為本文的共同通訊作者。

https://www.nature.com/articles/s41589-026-02205-1

制版人： 十一

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