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突破性發(fā)現(xiàn)：AAV相關(guān)肝炎患者肝內(nèi)檢出斷裂基因組！

撰文：安一

基因治療曾被視為罕見病的救命稻草，尤其是腺相關(guān)病毒（AAV）載體，憑借其安全性和高效性，已成功用于脊髓性肌萎縮癥（SMA）、血友病等多種疾病的治療。截至2025年，美國FDA已批準(zhǔn)7款A(yù)AV基因療法，更多療法仍在臨床試驗中。

但光鮮背后，肝毒性始終是懸在AAV基因治療頭上的“達摩克利斯之劍”——靜脈輸注后，肝細胞損傷極為常見，部分患者甚至出現(xiàn)暴發(fā)性肝衰竭，不得不依賴大劑量激素治療。盡管這一問題已困擾臨床多年，但其背后的深層機制卻一直模糊不清。

近日，發(fā)表在《Nature Medicine》上的一項病例研究[1]，通過先進的宏基因組測序技術(shù)，首次在肝損傷患者的肝臟組織中發(fā)現(xiàn)了制造工藝殘留的質(zhì)粒序列、斷裂重組的載體基因組，以及潛在的輔助病毒感染，為破解AAV相關(guān)肝毒性的謎題提供了關(guān)鍵線索。

病例聚焦：7歲脊髓性肌萎縮女孩的治療困境

研究團隊聚焦于一名7歲女性脊髓性肌萎縮1型（SMA 1）型患者，該患者攜帶SMN1基因7號外顯子純合缺失，僅保留2個SMN2拷貝。由于體重超過20kg，她接受了高劑量的onasemnogene abeparvovec（OA，一款獲批用于SMA治療的AAV9載體基因療法），總劑量達2.2×101?載體基因組（vg）。

治療后不久，患者就出現(xiàn)了明顯的肝炎癥狀：嘔吐、黃疸、腹痛伴尿色加深。實驗室檢查顯示，血清肝損傷標(biāo)志物在輸注后7周達到峰值，其中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）升至1236 U/L，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）362 U/L，總膽紅素137 μmol/L，提示嚴(yán)重的肝細胞損傷和膽汁淤積。

臨床團隊隨即采用激素聯(lián)合他克莫司進行治療，他克莫司在7個月后成功停藥，但激素治療持續(xù)了19個月才逐步減量。為明確肝損傷的根本原因，醫(yī)生在患者肝損傷峰值時進行了肝穿刺活檢，并開展了全面的基因組學(xué)分析。

測序揭秘：肝臟中藏著“制造殘留”質(zhì)粒

研究團隊對患者肝臟組織樣本進行了短讀長和長讀長宏基因組測序，同時結(jié)合原位雜交技術(shù)，意外發(fā)現(xiàn)了三類本不該出現(xiàn)在患者體內(nèi)的不速之客——OA制造過程中使用的三種質(zhì)粒序列。

OA的生產(chǎn)需要依賴三種關(guān)鍵質(zhì)粒（圖1）：pSMN（攜帶治療性SMN基因）、pAAV2/9（提供AAV2復(fù)制基因rep和AAV9衣殼基因cap）、pHelper（提供腺病毒輔助復(fù)制基因）。理論上，經(jīng)過嚴(yán)格的生產(chǎn)純化，最終輸注給患者的應(yīng)只有包裹著SMN基因的AAV9病毒顆粒，質(zhì)粒片段應(yīng)被完全去除。

但測序結(jié)果顯示，患者肝臟中不僅存在完整的OA載體基因組，還檢測到了pSMN的質(zhì)粒骨架、pAAV2/9的全長序列，以及部分pHelper片段。原位雜交驗證進一步證實，5.1%的肝細胞中存在三種質(zhì)粒共有的細菌復(fù)制起點序列，5.8%的肝細胞中檢測到pAAV2/9特有的AAV9衣殼基因序列，而SMN基因的陽性細胞比例達28.5%（對照組僅0.4%-1.5%），明確了這些質(zhì)粒序列并非測序污染，而是真實存在患者肝臟中。

圖1 制備OA所用質(zhì)粒的示意圖及其作用機制

更值得關(guān)注的是，這些質(zhì)粒序列并非完整存在，而是以片段形式與載體基因組相互融合，形成了復(fù)雜的重組產(chǎn)物。研究人員推測，這些質(zhì)粒殘留可能是生產(chǎn)過程中“反向包裝”或純化不徹底導(dǎo)致的，而它們在體內(nèi)與載體基因組的重組，可能觸發(fā)了異常的免疫反應(yīng)或直接損傷肝細胞。

基因組亂象：斷裂、串聯(lián)與跨界融合

除了質(zhì)粒污染，測序還揭示了載體基因組在患者肝臟中的混亂狀態(tài)。正常情況下，AAV載體進入肝細胞后，會以單鏈DNA形式釋放，隨后形成雙鏈DNA，并組裝成環(huán)狀游離體進行基因表達。但該患者的載體基因組卻出現(xiàn)了三大異常（圖2）：

1

廣泛斷裂與串聯(lián)化

載體基因組發(fā)生了大量斷裂，同時通過“頭對頭”“頭對尾”等方式串聯(lián)形成多聚體，這種結(jié)構(gòu)與AAV復(fù)制過程中的滾環(huán)擴增特征相似。部分串聯(lián)后的DNA長度超過15 kb，遠超AAV載體5 kb的最大包裝容量，說明這些結(jié)構(gòu)不可能是生產(chǎn)過程中包裝進去的，而是在患者體內(nèi)形成的。

2

質(zhì)粒-載體-人類基因組重組

長讀長測序發(fā)現(xiàn)，許多重組片段同時包含質(zhì)粒序列（如pAAV2/9的rep/cap基因、pHelper的腺病毒基因）、載體基因組和人類基因組序列，形成了復(fù)雜的“三方融合體”。短讀長測序進一步證實，載體基因組與人類基因組之間存在大量融合連接點，分布在多個基因內(nèi)部，但未發(fā)現(xiàn)明顯的整合熱點區(qū)域。

3

內(nèi)部重排與異常轉(zhuǎn)錄

載體基因組自身也發(fā)生了頻繁的內(nèi)部重排，主要集中在反向末端重復(fù)序列（ITR）區(qū)域，同時檢測到非經(jīng)典剪接融合產(chǎn)物。不過幸運的是，這些異常重排的DNA大多沒有產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄本，未形成大量異常蛋白。

圖2 肝活檢結(jié)果

a. 患者肝活檢可見顯著的門周炎癥、小葉炎癥及界面性炎癥，同時存在大量伴氣球樣變性的肝細胞。

b. 圖a 框選區(qū)域的高倍鏡視野，可見氣球樣變肝細胞的胞質(zhì)呈明顯腫脹表現(xiàn)。

c. 圖 a 中標(biāo)記區(qū)域的放大視野。

d. 圖 a 中標(biāo)記區(qū)域的放大視野

e~g. 采用免疫組織化學(xué)（IHC）染色檢測 CD20（e）、CD8（f）及 CD4（g）的表達，顯示肝臟組織內(nèi)的炎癥浸潤情況。

h. 腺病毒免疫染色結(jié)果為陰性。

研究人員分析，這些復(fù)雜結(jié)構(gòu)的形成可能與質(zhì)粒殘留中的rep基因、腺病毒輔助基因表達有關(guān)——這些基因可能激活了載體基因組的異常復(fù)制，進而導(dǎo)致斷裂、串聯(lián)和重組；也可能是ITR序列驅(qū)動的分子間重組所致。

意外發(fā)現(xiàn)：HHV-6B感染的潛在角色

在基因組分析中，研究團隊還意外檢測到了人類β皰疹病毒6B（HHV-6B）的完整基因組，PCR驗證顯示其循環(huán)閾值（CT）為26.2，提示患者存在HHV-6B感染，但未檢測到該病毒的RNA轉(zhuǎn)錄本，說明此時病毒處于潛伏狀態(tài)。

HHV-6B之所以值得關(guān)注，是因為它可能作為“輔助病毒”促進AAV的復(fù)制。此前研究發(fā)現(xiàn)，HHV-6家族病毒能提供AAV復(fù)制所需的關(guān)鍵因子，而在野生型AAV2相關(guān)的兒童肝炎患者肝臟中，也常能檢測到HHV-6感染。

不過，由于這是單病例研究，目前尚無法確定HHV-6B感染是肝損傷的直接原因，還是通過促進AAV載體異常復(fù)制間接加重?fù)p傷，這一關(guān)聯(lián)仍需更多病例驗證。

臨床啟示：基因治療的安全邊界在哪？

這項研究雖然僅聚焦于一名患者，但揭示的現(xiàn)象為理解AAV相關(guān)肝毒性提供了全新視角，也給臨床實踐和療法開發(fā)帶來了重要啟示：

1

肝毒性機制可能是“多重打擊”

以往認(rèn)為，AAV肝毒性主要與衣殼蛋白引發(fā)的免疫反應(yīng)有關(guān)，但本研究提示，制造殘留的質(zhì)粒序列、異常重組的載體基因組、潛在的輔助病毒感染可能共同構(gòu)成“多重打擊”，觸發(fā)肝細胞損傷或免疫激活。尤其是質(zhì)粒中的細菌序列（如復(fù)制起點、抗生素抗性基因），可能通過TLR9通路激活先天免疫，這與此前發(fā)現(xiàn)的“載體外DNA引發(fā)免疫反應(yīng)”的結(jié)論一致。

2

生產(chǎn)工藝需要更嚴(yán)格的質(zhì)控

目前，即使遵循良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP），AAV制劑中仍可能殘留少量質(zhì)粒片段、空衣殼等雜質(zhì)。研究結(jié)果提示，這些“微量雜質(zhì)”可能具有顯著的生物學(xué)效應(yīng)，未來需要優(yōu)化純化工藝，進一步降低質(zhì)粒殘留和異常重組產(chǎn)物的含量，同時加強對制劑中雜質(zhì)的檢測和定量。

3

臨床監(jiān)測需關(guān)注“基因組異?！?/strong>

對于接受高劑量AAV基因治療的患者，尤其是體重較大的年長患者（本研究患者肝毒性更嚴(yán)重，與此前觀察到的“高劑量、高體重患者風(fēng)險更高”一致），除了常規(guī)監(jiān)測肝酶，未來可能需要開發(fā)無創(chuàng)檢測方法，監(jiān)測體內(nèi)質(zhì)粒殘留和載體基因組重組情況，提前預(yù)警肝損傷風(fēng)險。

4

仍需更多研究驗證因果關(guān)系

需要強調(diào)的是，這是一項單病例研究，仍有諸多問題待解答：質(zhì)粒殘留和異?；蚪M結(jié)構(gòu)在無肝損傷的AAV治療患者中是否存在？HHV-6B感染與肝損傷的關(guān)聯(lián)是否具有普遍性？這些異常結(jié)構(gòu)是導(dǎo)致肝損傷的直接原因，還是損傷后的結(jié)果？

未來，需要開展更大規(guī)模的隊列研究，對比肝損傷與無肝損傷患者的肝臟組織樣本，明確這些異常現(xiàn)象與肝毒性的因果關(guān)系，同時探索如何通過優(yōu)化載體設(shè)計、生產(chǎn)工藝和聯(lián)合用藥，降低肝損傷風(fēng)險。

參考文獻：

[1]Buddle S, Brown LK, Morfopoulou S, et al. Contaminating plasmid sequences and disrupted vector genomes in the liver following adeno-associated virus gene therapy. Nat Med. 2026 Jan 16.

責(zé)任編輯：葉子

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