廣東
近日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞團隊在Nature Biotechnology期刊在線發表了題為Multiplexed, precise genome engineering in monocots with twin prime editing systems的研究論文。研究團隊開發了精準基因敲除工具TKO（TwinPE-mediated gene KnockOut）以及“多合一”的基因組編輯系統TRIM（TKO editor-enabled gene Rupture and development of Integrated Multitype genome modification systems），為復雜性狀的“一站式”精準聚合提供了全新解決方案。中科院遺傳發育所高彩霞團隊助理研究員李洪超（現為崖州灣國家實驗室玉米團隊青年科學家）與博士后柴壯壯為本論文的共同第一作者，高彩霞研究員為通訊作者。
精準敲除工具TKO的開發
PE系統能夠實現任意類型的堿基替換和小片段編輯，但在基因敲除方面仍缺乏高效、穩定且通用的解決方案。為此，研究團隊首先基于雙pegRNA引導編輯（twinPE）策略，在目標位點精準插入終止密碼子簇（stop codon cluster，SCC），開發出精準高效的基因敲除工具TKO。與傳統Cas9依賴隨機插入缺失（indel）實現基因失活不同，TKO通過精準寫入終止密碼子，實現確定性的基因功能敲除，從而有效避免Cas9系統中常見的3n倍數插入缺失導致的突變（in-frame indel）問題。在水稻、小麥和玉米等單子葉作物的原生質體中，TKO均表現出高效的敲除能力。在水稻再生T0植株中，TKO介導的單基因敲除的平均效率達到96.8%。
進一步，研究團隊開發了10套彼此正交的TKO系統，實現多達10個基因的同時精準敲除。在小麥TaKRN2三個同源基因的同步敲除實驗中，TKO效率達到Cas9系統的5.2倍，顯示出在多基因和多倍體作物編輯中的顯著優勢。
多合一”TRIM系統的建立
在此基礎上，研究團隊進一步提出“多合一”編輯理念，希望構建單一編輯系統同步實現基因敲除、精準編輯和基因組重構。研究團隊將TKO與常規PE編輯策略相結合，開發出兩個“多合一”TRIM編輯系統。在TRIM1系統中，利用常規PE蛋白作為工具酶，采用TKO策略實現基因敲除，同時通過常規PE策略實現堿基替換、小片段替換、插入、刪除、復制、倒位等多種編輯。在水稻再生T0植株中，TRIM1實現同時對1個基因敲除與3個基因純合精準編輯的效率達到22.8%。為進一步擴展編輯能力，研究團隊開發了TRIM2系統。TRIM2采用PE與Cre重組酶的融合蛋白作為工具酶，在保留TRIM1全部功能的基礎上，進一步實現Kb級大片段DNA的插入、替換、刪除、倒位和易位等復雜基因組操縱。與現有編輯工具通常只能完成少數類型編輯不同，TRIM首次將基因敲除、堿基編輯、小片段編輯以及大片段基因組重構整合到同一平臺，實現了真正意義上的“多合一”基因組工程。該系統能夠在同一植株中同步完成基因敲除、精準編輯和大片段基因組重構，實現多個優異等位基因的快速聚合，為復雜性狀設計育種提供了強有力的新工具，并有望顯著加速單子葉作物精準育種進程。
此外，為便于TKO的載體設計與構建，研究團隊開發了自動化軟件TKO_PegDesigner（tko-pegdesigner.net/），可協助用戶篩選優異靶點并設計載體構建所需引物。另外，為了便于多pegRNA載體的構建，團隊開發了two-round ligation (TRL) 的多(pe)gRNA組裝策略，利用兩輪連接反應（每輪最多連接6個片段），可實現多達36個(pe)gRNA的組裝。
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