細(xì)菌感染一直是威脅全球公共健康的重大問題。2019年，全球約有770萬人死于33種常見細(xì)菌病原體感染，其中大腸桿菌位列前五，在37個國家更是排名第一的細(xì)菌性致死原因。志賀氏菌每年導(dǎo)致1.65億例腹瀉和110萬人死亡，而變形桿菌則被世界衛(wèi)生組織列為重點病原體。面對日益嚴(yán)重的多重耐藥菌問題，疫苗研發(fā)迫在眉睫。近日，天然與仿生藥物研究江西省重點實驗室張慶舉團隊聯(lián)合華東理工大學(xué)楊友教授團隊、北京大學(xué)葉新山教授團隊，在《德國應(yīng)用化學(xué)》期刊上發(fā)表了一項重要研究成果——他們成功合成了針對大腸桿菌O29、志賀氏菌11型及變形桿菌O12的O-抗原寡糖，并開發(fā)出具有廣譜潛力的新型糖疫苗。

一、發(fā)現(xiàn)最優(yōu)抗原表位

這三種細(xì)菌的O-抗原結(jié)構(gòu)高度相似，都包含一個五糖重復(fù)單元。然而，其合成面臨巨大挑戰(zhàn)：每個重復(fù)單元含有五種不同的單糖殘基、三個難以構(gòu)建的1,2-順式糖苷鍵，以及復(fù)雜的甘油磷酸酯和胺基官能團。

研究團隊采用匯聚式合成策略，通過優(yōu)化糖基化反應(yīng)條件（如溶劑效應(yīng)和添加劑控制），成功構(gòu)建了這些復(fù)雜的糖鏈結(jié)構(gòu)。他們共合成了8個目標(biāo)分子，包括三糖、五糖、六糖和十糖等不同長度的寡糖片段。

為確定最佳的抗原表位，研究人員將合成的8種寡糖分別與載體蛋白HSA偶聯(lián)，并用滅活的大腸桿菌O29免疫小鼠獲得的血清進(jìn)行檢測。

令人驚訝的是，含有兩個核心三糖甘油磷酸亞基的六糖（化合物4）表現(xiàn)出最強的抗體識別能力，而包含一個或兩個完整五糖重復(fù)單元的糖鏈（化合物5-8）反而結(jié)合較弱。

研究團隊推測，這可能是由于五糖結(jié)構(gòu)中的支鏈二糖（由葡萄糖和半乳糖/半乳糖胺組成）起到了"誘餌"作用，阻礙了抗體對核心表位的識別。這一發(fā)現(xiàn)對理解細(xì)菌O-抗原的免疫識別機制具有重要意義。

二、疫苗候選物展現(xiàn)良好免疫原性

• 模塊化砌塊構(gòu)建：制備 21–29 全套單糖保護(hù)砌塊，搭建核心三糖中間體；

• 收斂式組裝

• [2+1] 糖苷化：搭建核心三糖骨架；

• [3+3] 磷酸縮合：合成六糖（2 個核心三糖重復(fù)單元）；

• [3+1+1] 分步偶聯(lián)：規(guī)避位阻沖突，高效制備五糖重復(fù)單元；

• [5+5] 磷酸拼接：組裝十糖（兩組完整五糖 O 抗原單元）

聚焦科技領(lǐng)域

以單糖砌塊 24–29 為原料合成關(guān)鍵中心三糖中間體 19 與 20（方案 1）：

1. 先經(jīng)兩步反應(yīng)制備二糖供體 24：供體 26 與受體 27 在 TfOH 催化糖基化得到二糖 30，脫除異頭 TBS 后轉(zhuǎn)化為亞胺酯供體 24，兩步后總收率 64%；

2. 再制備甘油修飾受體 25：硫代糖苷 28 與甘油 29 經(jīng) NIS/TMSOTf 催化偶聯(lián)得 31（91% 產(chǎn)率），HF / 吡啶脫硅基得到受體 25（96% 產(chǎn)率）；

3. 篩選多種催化、添加劑體系構(gòu)建高難度 1,2 - 順式糖苷鍵：常規(guī)催化劑、DMF 添加劑均無法兼顧高產(chǎn)率與 α 立體選擇性；采用二氯甲烷 / 乙醚混合溶劑調(diào)控溶劑效應(yīng)，最終以 91% 收率、超高 α 選擇性（α:β＞20:1）得到三糖 19；

4. 碳酸鉀甲醇溶液選擇性脫除 19 乙?；玫饺鞘荏w 20，收率 75%。

方案2 三糖目標(biāo)物3和六糖4的合成。

方案3

(A) 通過[2 + 3]糖基化合成五糖15。

(B) 通過[3 + 1 + 1]糖基化合成五糖15/15’。(C) 合成目標(biāo)五糖5和十糖6。

方案4

(A) 通過[3 + 1 + 1]糖基化反應(yīng)合成五糖15’。

(B) 合成五糖目標(biāo)物7和十糖8。

三、制備和表征CRM197-4糖綴合物的最佳糖類表位。

（A）免疫方案及通過ELISA檢測第35天用弗氏佐劑（FA）配制的滅活大腸桿菌O29免疫小鼠的混合血清（1:1000稀釋）對八種糖綴合物的識別情況。每組包含8只小鼠。P/N比值表示陽性免疫小鼠血清與陰性未免疫小鼠血清的OD值之比。P/N比值以三重復(fù)測定，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。

（B）使用二(N-琥珀酰亞胺基)戊二酸酯（DSG）作為交聯(lián)試劑將化合物4與載體蛋白CRM197偶聯(lián)。（C）以CRM197為標(biāo)準(zhǔn)品，采用MALDI-TOF分析CRM197-4糖綴合物的平均分子量。（D）使用PageBlue蛋白染色液對CRM197-4糖綴合物和CRM197進(jìn)行SDS-PAGE分析。左側(cè)標(biāo)示了標(biāo)記條帶的分子量。

圖4 ELISA法分析血清抗體滴度。

（A）免疫方案。C57BL/6J小鼠（n = 6）于第0天皮下注射CRM197-4（每劑含糖0.4 μg），隨后在第14天和第28天分別使用弗氏佐劑（FA）配制的CRM197-4（每劑含糖2 μg）進(jìn)行加強免疫。對照組小鼠（n = 6）僅接受PBS或含F(xiàn)A的PBS。

（B）不同時間點的IgG滴度（稀釋倍數(shù)1:10，000）。（C–H）通過ELISA檢測第35天血清中的IgG、IgM及IgG亞類。ELISA實驗中以HSA-4糖綴合物作為包被抗原。抗體滴度以三重復(fù)測定，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差。

圖5 使用抗CRM197-4抗體識別滅活的E. coli O29。

（A）E. coli O29表面染色。采用（a）未經(jīng)血清處理的細(xì)菌、（b）未接種疫苗小鼠的混合血清以及（c）用FA配制的CRM197-4偶聯(lián)物免疫后的小鼠混合血清，對滅活的E. coli O29進(jìn)行免疫熒光染色。相應(yīng)的a′–c′圖顯示明場圖像，a″–c″圖顯示疊加圖像。

（B）將滅活的E. coli O29分別與抗CRM197-4+FA血清或預(yù)免疫血清孵育，隨后使用FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG進(jìn)行表面染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。單獨的細(xì)菌作為背景對照。

四、總結(jié)

本研究首次全合成大腸桿菌 O29、普通變形桿菌 O 抗原對應(yīng)的 8 種寡糖：

合成層面：結(jié)合遠(yuǎn)程鄰基參與、添加劑調(diào)控、溶劑效應(yīng)實現(xiàn)難構(gòu)建的 1,2 - 順式糖苷鍵，借助匯聚式路線高效合成六糖、十糖；產(chǎn)物 5/6/7/8 核磁數(shù)據(jù)與天然細(xì)菌多糖匹配，結(jié)構(gòu)得到確證。

免疫篩選：六糖 4（含兩段核心三糖甘油磷酸單元）為最優(yōu)抗原表位，側(cè)鏈分支二糖會干擾抗體識別。

疫苗開發(fā)：將六糖 4 偶聯(lián) CRM197 得到糖綴合疫苗，可激發(fā)高效特異性免疫，抗體能結(jié)合大腸桿菌 O29 菌體表面抗原，具備覆蓋大腸桿菌、痢疾志賀菌、普通變形桿菌、丙二酸鹽克羅諾桿菌的廣譜抗感染潛力，為廣譜抗感染疫苗提供全新分子模板。

原文鏈接：https://doi.org/10.1002/anie.5838072

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來源| Chemsynth Psot

校稿| Alice編審| Hide / Blue sea

編輯 設(shè)計| Leon