編輯丨王多魚

排版丨水成文

骨骼健康是全球公共衛(wèi)生體系中不容忽視的重要議題，隨著人口老齡化的不斷加劇，以骨質(zhì)疏松為代表的代謝性骨病受到廣泛關(guān)注。骨質(zhì)疏松癥是一種由多種原因引發(fā)的全身性骨病，其主要特征為骨密度和骨質(zhì)量下降、骨微結(jié)構(gòu)退變，導(dǎo)致骨脆性增加，從而易引發(fā)骨折。

增強(qiáng)子作為一類非編碼調(diào)控元件，近年來受到廣泛關(guān)注。越來越多的研究證實，增強(qiáng)子在調(diào)控關(guān)鍵基因表達(dá)和決定細(xì)胞命運(yùn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其與很多疾病緊密相關(guān)，比如癌癥、血管疾病、心臟疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及骨質(zhì)疏松癥等。高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，使得在全基因組范圍內(nèi)篩選有活性的增強(qiáng)子和解析其分子調(diào)控機(jī)制成為可能。全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）已鑒定出數(shù)百個骨質(zhì)疏松易感遺傳位點，其中絕大多數(shù)變異位點富集于增強(qiáng)子區(qū)域。然而，目前增強(qiáng)子在骨形成與骨質(zhì)疏松中的作用分子機(jī)制尚未被充分解析。

近日，北京航空航天大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院李春燕課題組在Nature Communications期刊發(fā)表了題為：Enhancer-mediated Etv4 activation stimulates osteogenic differentiation 的研究成果。

該研究通過整合 RNA-seq 和 ChIP-seq 等組學(xué)數(shù)據(jù)成功篩選出在成骨過程中起關(guān)鍵作用的增強(qiáng)子，運(yùn)用 CRISPR-Cas9 和 CUT&Tag 等技術(shù)，結(jié)合 Hi-C 數(shù)據(jù)等，從“順式調(diào)控元件→反式調(diào)控因子→靶基因”的調(diào)控層面，通過體內(nèi)和體外實驗驗證了成骨分化和骨形成過程中“enh11→ Stat3→ Etv4”這一關(guān)鍵調(diào)控軸，闡明了 enh11 介導(dǎo)的調(diào)控通路在成骨分化和骨形成中的分子機(jī)制，為骨質(zhì)疏松癥提供了潛在治療靶點。

1、篩選參與骨形成的活性增強(qiáng)子

為篩選參與成骨分化和骨形成的特異性功能增強(qiáng)子，研究團(tuán)隊從公共數(shù)據(jù)庫中獲取人和鼠未分化及成骨分化的間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并結(jié)合 FANTOM5 與 EnhancerAtlas 2.0 兩大權(quán)威增強(qiáng)子注釋數(shù)據(jù)庫，成功篩選出可能促進(jìn)成骨細(xì)胞向分化的位于小鼠 11 號染色體上的一個增強(qiáng)子（命名為“enh11”）。同時分析了其物種保守同源基因，確保研究結(jié)果的跨物種適用性。

2、特異性敲除 enh11 抑制了成骨細(xì)胞系的分化

為探究 enh11 在成骨分化和骨形成過程中的生物學(xué)功能，研究團(tuán)隊利用 CRISPR-Cas9 技術(shù)構(gòu)建了 enh11 特異性敲除的成骨前體細(xì)胞系（MC3T3-E1 enh11-/-）。并通過 ALP 染色、茜素紅染色以及骨相關(guān)的標(biāo)志物 mRNA 水平驗證，enh11 敲除可顯著抑制成骨細(xì)胞分化。

3、enh11 條件型敲除小鼠骨形成能力下降

為進(jìn)一步驗證 enh11 在體內(nèi)骨形成中的生物學(xué)功能，研究團(tuán)隊利用 CRISPR-Cas9 技術(shù)構(gòu)建 enh11 成骨細(xì)胞特異性敲除小鼠模型。對 2 月齡雌性小鼠進(jìn)行體內(nèi)功能實驗驗證，結(jié)合 Micro-CT、組織學(xué)染色以及對成骨分化相關(guān)基因的定量分析，結(jié)果顯示，enh11 成骨細(xì)胞特異性敲除會導(dǎo)致小鼠骨量下降和骨微結(jié)構(gòu)破壞，從而證明了 enh11 是調(diào)控成骨細(xì)胞分化與骨形成的關(guān)鍵順式調(diào)控元件。上述結(jié)果在雌雄小鼠中均得到驗證。

4、靶基因Etv4參與成骨細(xì)胞的分化

為解析 enh11 介導(dǎo)的下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究團(tuán)隊對 enh11 敲除細(xì)胞及對照細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序與差異表達(dá)基因分析，結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫 Hi-C 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，提示了 Etv4 是 enh11 的潛在靶基因。研究團(tuán)隊還進(jìn)行了熒光素酶報告基因?qū)嶒灒⒗?siRNA 敲低 Etv4 對成骨分化表型進(jìn)行觀測。結(jié)果表明，Etv4 是 enh11 的關(guān)鍵下游靶基因，參與調(diào)控成骨細(xì)胞的分化。

5、Etv4敲除小鼠骨形成能力下降

研究團(tuán)隊通過對 2 月齡野生型（WT）與 Etv4 基因敲除（Etv4-KO）小鼠的表型分析，發(fā)現(xiàn)與 WT 小鼠相比，Etv4-KO 小鼠在體重、骨量及骨微結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù)上均存在顯著差異，表明 Etv4 基因敲除可明顯抑制小鼠體內(nèi)骨形成。上述結(jié)果在雌雄小鼠中均得到驗證。

6、Stat3 與 enh11 結(jié)合調(diào)控Etv4的表達(dá)

研究團(tuán)隊通過轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫的整合分析，預(yù)測 Stat3 可結(jié)合于 enh11 區(qū)域及 Etv4 啟動子區(qū)域。在 MC3T3E1 細(xì)胞中利用 siRNA 敲低 Stat3，CUT&Tag 結(jié)果顯示，Stat3 的敲低使 Stat3 與 enh11 與 Etv4 啟動子區(qū)域的結(jié)合均降低，同時伴隨 Etv4 表達(dá)顯著下降。

為進(jìn)一步驗證 enh11 對成骨細(xì)胞分化的調(diào)控依賴于與轉(zhuǎn)錄因子 Stat3 的結(jié)合，研究團(tuán)隊從 JASPAR 數(shù)據(jù)庫獲取轉(zhuǎn)錄因子 Stat3 的結(jié)合基序（motif），運(yùn)用 CRISPR-Cas9 技術(shù)特異性敲除 enh11 區(qū)域 Stat3 的結(jié)合序列。ALP 染色、茜素紅染色及成骨分化標(biāo)志物檢測等結(jié)果顯示 enh11 區(qū)域 Stat3 結(jié)合位點的缺失可顯著抑制成骨細(xì)胞分化，從而證明 Stat3 與 enh11 的特異性結(jié)合是介導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵。

總的來說，該研究表明，enh11 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 Stat3，調(diào)控了靶基因 Etv4 的表達(dá)，從而影響了成骨分化與骨形成。

這項研究整合了轉(zhuǎn)錄組、表觀組、三維基因組及表型組等多組學(xué)數(shù)據(jù)，從“順式調(diào)控元件→反式調(diào)控因子→靶基因”的角度，系統(tǒng)揭示了“enh11→ Stat3→ Etv4”關(guān)鍵調(diào)控軸在成骨分化與骨形成中的關(guān)鍵作用，從分子機(jī)制到生理功能實現(xiàn)了完整的邏輯閉環(huán)，為骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病提供了全新的分子機(jī)制與潛在治療靶點。

北京航空航天大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院李春燕副教授為論文通訊作者，博士研究生張俊有（已畢業(yè)，現(xiàn)就職于首都醫(yī)科大學(xué)附屬世紀(jì)壇醫(yī)院）、王棨臨（已畢業(yè)）、成卓玉和劉家欣為論文共同第一作者。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41467-026-70796-3