Nature Commun | 中國科學院微生物研究所周姍姍團隊實現4-烷基丁烯醇ides的不對稱綠色合成

丁烯醇ides是一類含有α,β-不飽和五元內酯結構的化合物，廣泛存在于具有生物活性的天然產物中，也是多種合成藥物的重要藥效團。其α,β-不飽和酯的親電性和γ-去質子化產生的二烯醇鹽的親核性，使其成為構建多樣化分子結構的多功能合成模塊，因此一直是有機合成領域的研究熱點。目前丁烯醇ides的化學合成主要依賴兩種策略：一是通過分子內或分子間環化反應構建核心骨架；二是通過對已構建的呋喃酮前體進行功能化修飾。然而，這些方法通常需要多個合成步驟和試劑，過程繁瑣、成本高昂且從可持續性角度看不夠理想。

近日，中國科學院微生物研究所周姍姍研究員團隊在《Nature Communications》發表了題為《Trifunctional flavoenzyme-catalyzed asymmetric 4-alkyl-butenolide assembly in avenolide biosynthesis》的研究論文。該研究揭示了鏈霉菌中調控阿維菌素產生的激素分子avenolide的生物合成機制，發現一個三功能黃素酶能夠以脂肪酸酰基硫酯為底物，通過連續的去飽和、羥基化和內酯化反應，高效組裝手性4-烷基丁烯醇ide結構。

研究團隊首先在改造的Streptomyces albidoflavus宿主中異源表達avenolide生物合成基因savAB，成功實現了avenolide的高水平生產。通過高分辨率質譜分析發現，在1?O?氣氛下培養的菌株產生的avenolide中，最多有三個氧原子被1?O標記，表明分子中的三個氧原子來源于分子氧，為后續酶功能研究奠定了基礎。

為進一步闡明SavA的功能，研究團隊在大腸桿菌中表達了重組SavA蛋白并純化至均一。該蛋白呈黃色，UV-Vis吸收光譜顯示典型的氧化型黃素特征，經鑒定其結合的輔因子為FAD。以化學合成的10-甲基十二烷酰泛酰巰基乙胺硫酯為底物進行酶活測定，LC-MS分析發現主要產物為丁烯醇ide 3，同時檢測到少量α,β-不飽和中間體2。時間進程分析顯示，隨著反應時間延長，丁烯醇ide 3逐漸累積，而中間體2先增加后減少，證實2是反應中間體。通過化學合成立體異構體標準品對比，確定SavA催化生成的是單一手性的丁烯醇ide。

研究發現SavA催化丁烯醇ide形成不需要外源FAD或還原劑，表明其結合的FAD輔因子在反應中僅起催化作用，分子氧是唯一的化學計量試劑。動力學分析顯示，當底物濃度高于200 μM時出現明顯的底物抑制效應。進一步通過1?O?標記實驗證實，丁烯醇ide環上的氧原子來源于分子氧。序列比對和AlphaFold3結構預測結合定點突變實驗表明，Glu418是催化α-質子抽取的關鍵殘基，而Asp420雖對FAD結合重要但不直接參與催化。基于這些發現，研究團隊提出了SavA的催化機制：首先進行Z構型α,β-去飽和反應產生FADH2，FADH2與O2反應形成C4a-黃素氫過氧化物，然后對γ位進行羥基化，最終自發內酯化形成丁烯醇ide。

對于SavB的功能研究顯示，該P450酶以SavA產生的丁烯醇ide 3為底物，在NADPH、鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶存在下，通過三步連續的區域和立體特異性羥基化反應將其轉化為avenolide。時間進程分析發現兩個中間產物11和12，通過NMR波譜鑒定11為C9羥基化中間體，12為其酮基衍生物。以分離的中間體為底物的酶活測定進一步證實SavB按順序催化：先進行C9單羥基化生成11，然后將11轉化為12（可能通過C9脫氫或二羥基化-脫水），最后進行C10羥基化生成終產物avenolide。

中國科學院微生物研究所博士研究生李文睿和趙金蓮博士為該論文的共同第一作者，周珊珊研究員為文章通訊作者。該研究得到國家重點研發計劃、中國科學院戰略性先導科技專項和國家自然科學基金等項目的資助。

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