我國是肝臟疾病高負擔(dān)國家，現(xiàn)有約7 500萬慢性乙型肝炎患者及1 000萬丙型肝炎患者。同時，受環(huán)境變遷、生活方式轉(zhuǎn)變及飲食結(jié)構(gòu)改變等因素影響，非病毒性肝病（如酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病和藥物性肝損傷）發(fā)病率持續(xù)攀升，嚴(yán)重威脅國民健康。

肝臟作為核心代謝的器官，在代謝廢物和毒素降解過程中會大量產(chǎn)生超氧陰離子自由基、過氧化氫以及羥自由基等活性氧（ROS），這些物質(zhì)主要來源于線粒體電子傳遞鏈、細胞色素P450及NADPH氧化酶系統(tǒng)。在正常生理條件下，這些ROS分子參與調(diào)控細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝過程；然而在病理狀態(tài)下，ROS過度累積會引發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA損傷，進而驅(qū)動肝損傷進展。

大量研究表明，補充高效天然抗氧化劑可有效清除自由基、調(diào)節(jié)氧化還原平衡，對疾病預(yù)防與健康提升具有重要意義。其中，食源性蛋白肽因具備易吸收、低致敏性和多樣生物活性等特點，已成為功能性食品開發(fā)的理想組分。目前，多種動植物（如魚類、乳類、亞麻籽等）來源的抗氧化肽已在食品與藥品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。牦牛乳作為高營養(yǎng)價值乳源，其必需氨基酸與非必需氨基酸的組成比例均明顯優(yōu)于普通畜乳。酪蛋白約占牦牛乳總蛋白的80%，除具備卓越的乳化穩(wěn)定性和起泡特性外，還因其獨特的酶解敏感性，可通過蛋白水解作用釋放多種功能活性肽段，包括阿片肽、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽、免疫調(diào)節(jié)肽及抗氧化肽等，展現(xiàn)出治療潛力。

盡管一些研究已證實，牦牛乳酪蛋白酶解多肽具有顯著的化學(xué)抗氧化能力及對非肝細胞模型（巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞）的保護作用，但其能否直接保護肝細胞抵御氧化應(yīng)激損傷仍缺乏實驗證據(jù)。這一關(guān)鍵問題嚴(yán)重限制了酪蛋白肽在肝病干預(yù)中的應(yīng)用轉(zhuǎn)化。因此，蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院的楊淑紅、李敏倩、邊亞琴等采用單酶/復(fù)酶組合策略酶解牦牛乳酪蛋白獲得不同酶解多肽溶液，以2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）陽離子自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力及AML12小鼠肝實質(zhì)細胞氧化應(yīng)激損傷細胞存活率為初篩指標(biāo)，優(yōu)選抗氧化活性多肽；通過DEAE-52纖維素柱層析與Sephadex G50凝膠層析分級純化抗氧化多肽組分；系統(tǒng)評價多肽組分對AML12細胞內(nèi)ROS、過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）、NO及炎癥因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）分泌的調(diào)控效應(yīng)，以期揭示酪蛋白酶解多肽對肝細胞氧化損傷的直接保護機制，為其在肝病治療產(chǎn)品開發(fā)中的轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供理論支撐。

1

酪蛋白酶解多肽自由基清除能力分析

選用5 種蛋白酶進行排列組合進行酶解，由于中性蛋白酶與堿性蛋白酶均能夠水解疏水性氨基酸，且中性蛋白酶酶解位點更廣泛，幾乎覆蓋堿性酶所有位點，因此在雙酶和三酶組合時剔除了包含堿性蛋白酶的組合，按照蛋白酶酶解活性的最佳pH值從高到低的順序進行酶解，共得到15 種酶解多肽。單酶酶解多肽分別為中性蛋白酶解多肽、木瓜蛋白酶解多肽、堿性蛋白酶解多肽、胃蛋白酶解多肽、胰蛋白酶解多肽；復(fù)合雙酶酶解多肽有6 種：中木雙酶解多肽、木胃雙酶解多肽、中胃雙酶解多肽、胰胃雙酶解多肽、胰木雙酶解多肽、胰中雙酶解多肽；復(fù)合三酶酶解多肽有4 種：胰木胃三酶解多肽、中木胃三酶解多肽、胰中胃三酶解多肽、胰中木三酶解多肽。

將不同種類的酪蛋白酶解多肽樣品用水稀釋20 倍，采用DPPH法與ABTS法測定各多肽樣品的自由基清除能力。如表2所示，胰木胃三酶解多肽的DPPH自由基清除率最高，為（42.50±2.48）%，其ABTS陽離子自由基清除率為（84.62±5.99）%；而中胃雙酶解多肽的自由基清除率總體最低，分別為（21.97±0.60）%、（38.94±5.13）%。相比于單一蛋白酶解產(chǎn)物，混合酶解酪蛋白多肽的自由基清除能力普遍升高，這與已有報道一致。實驗數(shù)據(jù)表明，中性蛋白酶解多肽的ABTS陽離子自由基清除能力較高，推測可能是中性蛋白酶的切割位點為苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等疏水性氨基酸的氨基端或羧基端肽鍵，會釋放出大量疏水性氨基酸的短肽，這些短肽富含強大的電子供體和氫供體，可以有效清除ABTS陽離子自由基，因此具有較高的抗氧化活性。

2

酪蛋白酶解多肽對AML12細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用

細胞活性水平可以直觀反映細胞的生理狀態(tài)，因此，通過測定氧化應(yīng)激條件下AML12肝細胞的存活率，進而評價多肽的潛在保護作用。H2O2能夠直接氧化生物大分子（如脂質(zhì)和蛋白質(zhì)），促進自由基的大量積累，進而引發(fā)細胞損傷甚至死亡。因此，選用H2O2建立AML12細胞氧化應(yīng)激損傷模型。如圖1所示，H2O2氧化損傷AML12細胞的IC50為387 μmol/L。與氧化損傷組相比，谷胱甘肽組細胞存活率提高了83.48%，中性單酶解、胰木雙酶解和胰中胃三酶解多肽組（均稀釋至20 倍）的細胞存活率分別顯著提高至69.38%（P＜0.000 1）、65.95%（P＜0.000 1）、63.32%（P＜0.01）。因此選擇中性單酶解、胰木雙酶解和胰中胃三酶解多肽進行后續(xù)實驗。

3

DEAE-52纖維素柱層析分離多肽組分的抗氧化應(yīng)激損傷能力

DEAE-52纖維素柱色譜法主要用于分離純化多糖，多肽，核苷酸和酶。經(jīng)過酶解的酪蛋白多肽因為含有不同電荷，可以與DEAE-52纖維素交換材料相互作用而被交換吸附，再被不同濃度的NaCl溶液洗脫，從而達到分離的目的。如圖2A～C所示，經(jīng)不同濃度NaCl溶液洗脫得中性單酶解多肽含有4 個組分，按洗脫順序命名為Z1、Z2、Z3和Z4；胰木雙酶解多肽有3 個組分，按洗脫順序命名為YM1、YM2和YM3；胰中胃三酶解多肽有3 個組分，按洗脫順序命名為YZW1、YZW2和YZW3。

將分離得到的10 個多肽組分經(jīng)過透析除鹽、冷凍干燥后配制成不同質(zhì)量濃度的水溶液，利用MTT法檢測AML12細胞毒性作用，如圖2D、E所示，50～200 μg/mL多肽水溶液對細胞無明顯毒性。因此，選取200 μg/mL進行AML12細胞氧化應(yīng)激損傷實驗。如圖2F所示，與氧化損傷組相比，中性單酶解多肽Z1、Z2、Z3和Z4分離組分均表現(xiàn)出明顯的抗氧化應(yīng)激損傷作用，其中Z3的保護作用最強，其細胞存活率達到83.32%。胰木雙酶解多肽YM1和YM2分離組分對AML12細胞無抗氧化應(yīng)激損傷作用，而YM3表現(xiàn)出明顯的抗氧化應(yīng)激損傷作用，其細胞存活率達72.31%。胰中胃三酶解多肽YZW1和YZW3組分也表現(xiàn)出顯著的抗氧化應(yīng)激損傷作用，其細胞存活率分別為76.33%和77.18%。

4

Sephadex G-50凝膠層析分離多肽組分的抗氧化應(yīng)激損傷能力

基于分子質(zhì)量差異選用Sephadex G-50凝膠層析對樣品進行分離，進一步純化具有抗氧化活性的多肽組分。如圖3A～G所示，Z1分離得到3 種組分，按洗脫順序命名為Z1-A、Z1-B和Z1-C；Z2分離得到2 種組分，按洗脫順序命名為Z2-A和Z2-B；Z3分離得到2 種組分，按洗脫順序命名為Z3-A和Z3-B；Z4分離得到2 種組分，按洗脫順序命名為Z4-A和Z4-B；YM3分離得到2 種組分，按洗脫順序命名為YM3-A和YM3-B；YZW1分離得到3 種組分，按洗脫順序命名為YZW1-A、YZW1-B和YZW1-C；YZW3分離得到2 種組分，按洗脫順序命名為YZW3-A和YZW3-B。

將Sephadex G-50凝膠層析分離所得的多肽組分經(jīng)冷凍干燥后配制成不同質(zhì)量濃度的水溶液，采用MTT法檢測AML12細胞毒性作用。如圖3H、I所示，25～100 μg/mL多肽溶液對細胞無明顯毒性。因此，選取100 μg/mL進行AML12細胞氧化應(yīng)激損傷實驗。如圖3J所示，與氧化損傷組相比，Z1-C、Z3-B、YM3-B、YZW1-B和YZW3-B共5 種多肽組分表現(xiàn)出極其顯著的抗氧化應(yīng)激損傷作用（ P ＜0.000 1），其細胞活力分別為72.20%、74.45%、74.60%、75.11%、82.19%。

5

酪蛋白抗氧化肽對AML12細胞MDA、NO、IL-1β及TNF-α水平的影響

為闡明酪蛋白衍生抗氧化肽對H 2 O 2 所致AML12細胞損傷的保護機制是否涉及ROS調(diào)控，本研究通過DCFHDA熒光標(biāo)記技術(shù)定量分析細胞內(nèi)ROS含量變化。當(dāng)ROS過量積累時，細胞的抗氧化系統(tǒng)無法有效調(diào)節(jié)，進而誘發(fā)氧化應(yīng)激，造成顯著的氧化性細胞損傷 。DCFH-DA本身不具備熒光特性，經(jīng)細胞內(nèi)水解酶作用生成二氯二氫熒光素后，可被ROS氧化為熒光物質(zhì)二氯熒光素，進而會發(fā)出綠色熒光 。如圖4所示，空白對照組細胞ROS含量很低，加入H 2 O 2 后AML12細胞產(chǎn)生了大量的ROS，再加入Z1-C、Z3-B、YM3-B、YZW1-B、YZW3-B抗氧化多肽組分后，細胞內(nèi)綠色熒光強度出現(xiàn)不同程度的減弱（ P ＜0.05、 P ＜0.01、 P ＜0.000 1），說明這些多肽組分能夠顯著降低細胞中的ROS含量。

6

酪蛋白抗氧化肽對AML12細胞MDA、NO、IL-1β及TNF-α水平的影響

MDA作為脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志性產(chǎn)物，其過量蓄積會破壞由磷脂雙分子層和膜蛋白構(gòu)成的生物膜系統(tǒng)，最終導(dǎo)致細胞膜通透性改變和結(jié)構(gòu)完整性喪失。因此，檢測MDA水平可以評估機體脂質(zhì)過氧化的程度，進而間接反映細胞的氧化應(yīng)激損傷程度。將Z1-C、Z3-B、YM3-B、YZW1-B和YZW3-B抗氧化多肽分別與AML12細胞共同培養(yǎng)，收集細胞進行脂質(zhì)過氧化物含量測定，結(jié)果如圖5A所示。與空白對照組相比，5 種抗氧化多肽組分都能顯著降低AML12細胞的MDA濃度（P＜0.01、P＜0.000 1）。

炎癥是機體針對病原體、理化刺激或組織損傷所觸發(fā)的一種免疫防御反應(yīng)。當(dāng)細胞內(nèi)ROS水平升高時，會激活炎癥信號通路，促使受損細胞大量分泌促炎介質(zhì)（如NO、TNF-α和IL-1β等），引起周圍細胞的炎癥反應(yīng)，進一步導(dǎo)致組織損傷 。因此，通過測定細胞培養(yǎng)上清液的促炎介質(zhì)和炎癥因子表達水平，能夠有效評估細胞的炎癥反應(yīng)程度。如圖5B～D所示，H 2 O 2 處理AML12細胞后其培養(yǎng)液中NO、TNF-α和IL-1β水平急劇升高，說明H 2 O 2 誘發(fā)了AML12細胞的炎癥反應(yīng)，加入多肽組分后，NO、TNF-α和IL-1β水平均出現(xiàn)明顯下降。綜上，酪蛋白抗氧化多肽能夠抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和炎癥發(fā)生標(biāo)志物NO的表達，改善H 2 O 2 誘導(dǎo)AML12細胞的炎癥反應(yīng)。

結(jié) 論

本研究聚焦牦牛乳酪蛋白酶解多肽的抗肝細胞氧化應(yīng)激損傷作用，通過系統(tǒng)分析不同酶解產(chǎn)物的自由基清除能力及對H2O2誘導(dǎo)AML12肝實質(zhì)細胞應(yīng)激損傷的保護效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶解、胰木雙酶解及胰中胃三酶解多肽溶液（20 倍稀釋）不僅能夠顯著清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基，且在H2O2刺激下能將AML12細胞活力分別提升至69.38%、65.95%與63.32%。經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析與Sephadex G-50凝膠層析分級純化，篩選出5 種高效抗氧化多肽組分：Z1-C、Z3-B、YM3-B、YZW1-B及YZW3-B。通過熒光顯微成像及ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)上述5 種多肽組分可明顯降低肝細胞氧化損傷標(biāo)志物（ROS、MDA及NO）和炎癥因子（TNF-α、IL-1β）水平，證明牦牛乳酪蛋白多肽通過雙重調(diào)控氧化應(yīng)激與炎癥信號，展現(xiàn)出顯著的肝細胞保護活性。本研究系統(tǒng)揭示了牦牛乳酪蛋白酶解多肽抗肝細胞氧化應(yīng)激損傷的作用機制，可為開發(fā)靶向肝病干預(yù)的牦牛乳多肽功能食品提供理論支撐，對推動牦牛乳資源高值化利用具有實踐意義。

引文格式：

楊淑紅, 李敏倩, 邊亞琴, 等. 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的篩選及對肝細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用[J]. 食品科學(xué), 2026, 47(2): 104-112. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250715-119.

YANG Shuhong, LI Minqian, BIAN Yaqin, et al. Screening of antioxidant peptides from yak milk casein and their protective effects against oxidative stress injury in hepatocytes[J]. Food Science, 2026, 47(2): 104-112. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250715-119.

實習(xí)編輯：南伊；責(zé)任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

為匯聚全球智慧共探產(chǎn)業(yè)變革方向，搭建跨學(xué)科、跨國界的協(xié)同創(chuàng)新平臺，由北京食品科學(xué)研究院、中國肉類食品綜合研究中心、國家市場監(jiān)督管理總局技術(shù)創(chuàng)新中心（動物替代蛋白）、中國食品雜志社《食品科學(xué)》雜志（EI收錄）、中國食品雜志社《Food Science and Human Wellness》雜志（SCI收錄）、中國食品雜志社《Journal of Future Foods》雜志（ESCI收錄）主辦，西南大學(xué)、 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、 重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)盟、重慶工商大學(xué)、 重慶三峽科技大學(xué) 、西華大學(xué)、成都大學(xué)、四川旅游學(xué)院、北京聯(lián)合大學(xué)、 中國-匈牙利食品科學(xué)“一帶一路”聯(lián)合實驗室（籌）、 普洱學(xué)院 共同主辦 的“ 第三屆大食物觀·未來食品科技創(chuàng)新國際研討會 ”， 將于2026年4月25-26日 （4月24日全天報到） 在中國 重慶召開。

長按或微信掃碼進行注冊

為系統(tǒng)提升我國食品營養(yǎng)與安全的科技創(chuàng)新策源能力，加速科技成果向現(xiàn)實生產(chǎn)力轉(zhuǎn)化，推動食品產(chǎn)業(yè)向綠色化、智能化、高端化轉(zhuǎn)型升級，由北京食品科學(xué)研究院、中國食品雜志社《食品科學(xué)》雜志（EI收錄）、中國食品雜志社《Food Science and Human Wellness》雜志（SCI收錄）、中國食品雜志社《Journal of Future Foods》雜志（ESCI收錄）主辦，合肥工業(yè)大學(xué)、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)、安徽省食品行業(yè)協(xié)會、安徽大學(xué)、合肥大學(xué)、合肥師范學(xué)院、北京工商大學(xué)、中國科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床營養(yǎng)科、安徽糧食工程職業(yè)學(xué)院、安徽省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所、安徽科技學(xué)院、皖西學(xué)院、黃山學(xué)院、滁州學(xué)院、蚌埠學(xué)院共同主辦的“第六屆食品科學(xué)與人類健康國際研討會”，將于 2026年8月15-16日（8月14日全天報到）在中國 安徽 合肥召開。

長按或微信掃碼進行注冊

會議招商招展

聯(lián)系人：楊紅；電話：010-83152138；手機：13522179918（微信同號）