Nature Commun | 中山大學林天歆/陳旭團隊為癌癥免疫治療提供全新通用平臺

近年來，CRISPR-Cas基因編輯技術已成為生命科學和醫學領域的革命性工具。然而，傳統Cas蛋白（如Cas9、Cas12a）體積較大，超出了腺相關病毒（AAV）載體的包裝極限（<4.7 kb），嚴重限制了其在體內基因治療中的應用。因此，開發更小、更高效的基因調控系統，成為推動臨床轉化的關鍵突破口。

近日，中山大學孫逸仙紀念醫院林天歆教授與陳旭教授團隊在《自然·通訊》（Nature Communications）上發表題為《Miniature and versatile genome regulation TnpB-wRNA toolkits facilitate cancer immunotherapy》的研究論文。該研究通過對微型轉座子編碼核酸酶TnpB及其配套ωRNA的系統性工程化改造，成功構建出一套名為“enTnpB”的緊湊、高效且多功能的基因調控工具箱，并在癌癥免疫治療中展現出顯著療效。

研究團隊首先對TnpB的向導RNA——ωRNA進行了五輪理性設計。通過截短5’端非結構化區域、修剪遠端莖環、替換不穩定四環等策略，最終將ωRNA從原始的231個核苷酸縮短至93個核苷酸，同時將基因激活效率提升近1890倍。隨后，團隊對TnpB蛋白進行三輪定點突變篩選，發現將第255位天冬酰胺和第282位脯氨酸同時替換為精氨酸（N255R/P282R），可顯著增強其DNA結合能力。結合優化后的ωRNA，最終形成的基因激活系統“enTnpBa”在報告基因上實現了2889倍的激活提升，且體積遠小于此前報道的緊湊型激活劑CasMINI。全轉錄組測序顯示，enTnpBa具有高度特異性，脫靶效應極低。

在功能拓展方面，團隊基于enTnpB平臺成功開發了高效基因編輯器（enTnpB-GE）和腺嘌呤堿基編輯器（enTnpB-ABE）。其中，基因編輯器GE，且未檢測到明顯的脫靶事件；堿基編輯器ABE-γ和IL-15等多個位點實現了最高16.2%的A-to-G轉換，編輯窗口主要集中在間隔序列的第3至第10位。

最具轉化潛力的是，研究團隊利用enTnpBa的緊湊特性，將三個分別靶向CXCL9、IFN-γ和IL-15的ωRNA陣列與工程化TnpB蛋白一同包裝進單個AAV載體，構建出名為“AAV-ImmunAct”的單AAV免疫激活系統。在體外，該系統能顯著上調三種細胞因子的表達，并有效招募和激活CD8+ T細胞，增強其對膀胱癌細胞系及患者來源腫瘤類器官的殺傷能力。在采用人源化免疫重建小鼠的體內模型中，AAV-ImmunAct聯合抗PD-1治療顯著抑制了腫瘤生長，促進了CD8+ T細胞浸潤和顆粒酶B表達，并誘導腫瘤細胞凋亡。

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