Nature |?Hong Li團隊揭示一種對CpG甲基化敏感的Cas9蛋白——ThermoCas9

CRISPR-Cas9系統作為當今最重要的基因編輯工具之一，可以精準識別目標DNA序列，實現定點編輯。卻難以感知DNA 序列中的化學修飾。這些DNA化學修飾在表觀遺傳學中至關重要。例如胞嘧啶甲基化（5-methylcytosine, 5mC），在基因表達調控、細胞分化以及疾病發生中扮演著關鍵角色。如果能夠發現一種對DNA化學修飾敏感的新型CRISPR-Cas9系統，在識別基因序列的同時感知表觀遺傳狀態，特異性靶向編輯疾病相關的低甲基化基因將成為可能，為解決基因編輯技術的脫靶問題提供全新的維度。

2026年4月15日，美國Van Andel Institute（VAI）Hong Li教授團隊在Nature發表文章Molecular Basis for Methylation-sensitive Editing by Cas9，首次系統揭示了一種對CpG甲基化敏感的Cas9蛋白——ThermoCas9，并從生化機制、結構基礎到細胞功能層面全面解析了其作用機制及在人細胞中的應用潛力。這一成果突破了傳統Cas9系統無法識別DNA甲基化狀態的限制，為表觀遺傳信息的精準讀取與編輯提供了新的技術路徑。簡單來說，就是讓Cas9不只是“識別基因序列”，而是開始 “感知表觀遺傳學狀態”。

在此之前，Hong Li團隊已經發現另一種Cas9（AceCas9）對5mCpC有一定敏感性。然而，成熟體細胞組織中，5m CpG甲基化修飾更為常見，CpC甲基化修飾僅在胚胎干細胞中較為常見。相比之下，來自荷蘭Wageningen University 的John Van Der Oost 團隊鑒別了一種可以識別 CpG的Cas9——ThermoCas9，該Cas9有廣泛的潛力在人類細胞中進行有效基因編輯。為此，兩實驗室展開了合作。于是，一個自然的問題出現了：

ThermoCas9能不能識別更常見的5mCpG甲基化？

在該研究中，研究人員首先系統評估了ThermoCas9對DNA甲基化的敏感性。此前研究表明，ThermoCas9具有較寬松的PAM識別特性，但其對PAM第5位胞嘧啶（C）具有嚴格依賴。基于這一特征，研究團隊設計實驗，重點檢測該位點甲基化對酶活性的影響。

結果顯示，一旦PAM第5位發生甲基化，ThermoCas9對兩類PAM序列的切割活性均顯著降低，表明其對5mCpC和5mCpG均具有明顯敏感性。進一步分析發現，胞嘧啶甲基化對ThermoCas9的抑制具有鏈特異性：非靶鏈甲基化影響最大，靶鏈次之，而雙鏈同時甲基化時抑制最強。相比之下，protospacer區域（包括seed區）的甲基化幾乎不影響酶活性，說明ThermoCas9對甲基化的感知主要集中在PAM區域。

為探究其機制，研究人員進一步進行了競爭實驗和結合分析。結果發現，未甲基化DNA能夠有效競爭并抑制切割，而甲基化DNA即使在高濃度下也難以參與競爭；EMSA實驗同樣顯示，甲基化DNA幾乎無法與ThermoCas9形成穩定復合物。

這些結果表明，ThermoCas9對甲基化的響應發生在DNA識別早期階段，即甲基化降低了DNA結合能力進而抑制后續切割，而非直接影響催化過程。

高分辨率結構揭示甲基化敏感性的識別機制

研究團隊利用單顆粒冷凍電鏡（cryo-EM），解析了ThermoCas9在不同功能狀態下的結構，分辨率最高達到2.2 ?，包括：切割前狀態（pre-cleavage，2.8 ?），切割后狀態（post-cleavage 2.2?），單鏈DNA結合狀態（2.5 ?）。整體來看，ThermoCas9的結構框架與已報道的Cas9蛋白基本一致，由負責識別RNA-DNA雜交的REC結構域以及執行DNA切割功能的NUC結構域構成，體現出典型的Cas9分子架構。

在進一步解析ThermoCas9如何“讀取”DNA甲基化信息時，研究團隊通過高分辨率結構分析，明確了其PAM識別的獨特分子機制。與已報道的Cas9蛋白不同，ThermoCas9在PAM識別中呈現出一種嚴格識別關鍵堿基對的模式： Arg1035通過一對氫鍵識別G(-5)，Asp1017與Ser1019從DNA大溝側共同識別C(5*)，該區域空間高度緊湊，幾乎不允許額外化學基團進入。這一結構特征很好地解釋了其甲基化敏感性的來源：當C(5*)發生5位甲基化時，新增的甲基基團會產生明顯的空間位阻，干擾PAM識別過程，最終抑制ThermoCas9的活性。

從分子機制到疾病模型：ThermoCas9實現甲基化敏感的精準基因編輯

在明確ThermoCas9對甲基化修飾敏感的分子機制后，研究團隊發掘了其對不同甲基化圖譜的人類細胞進行差異性基因編輯的潛力。

他們先分析了ENCODE數據庫中不同細胞系的甲基化數據，發現大約3%–6%的CpG位點在不同細胞之間狀態完全相反，這些差異位點廣泛分布于啟動子、編碼區及非編碼區，其中包含大量與疾病相關的重要基因。這就帶來一個很有意思的可能性：同一段DNA，在不同細胞里，可以被“區別對待”。

基于對DNA元件百科全書（ENCODE）數據庫的分析，研究團隊選擇多個在HEK293（胚胎腎細胞） 和HCT116（結直腸癌細胞）中具有不同甲基化狀態的基因編輯位點進行驗證。實驗結果符合預期：ThermoCas9成功靶向編輯兩種細胞中均未被甲基化的位點；同時，無法編輯兩種細胞中均為甲基化的位點；而在差異性甲基化位點，則表現出明顯的選擇性編輯，對于同一位點，僅能靶向具有未甲基化表型的細胞系。這與經典的SpyCas9形成了鮮明對比——SpyCas9在所有位點均可進行編輯，不受甲基化狀態影響。

基于ThermoCas9的甲基化敏感特性，研究團隊還開發了一種結合PCR的甲基化檢測策略。利用ThermoCas9對基因組DNA進行甲基化敏感切割，并對位點兩側的DNA片段進行PCR擴增，從而通過PCR結果判斷目標位點的甲基化狀態。結果表明，當PAM序列中含有5mCpG 甲基化位點，ThermoCas9便無法切割， PCR得以順利進行。而未甲基化位點則會被特異性切割，使PCR產物減少或消失。這一方法證明ThermoCas9可用于篩選甲基化基因，為基于酶學反應的甲基化檢測提供了一種簡便的新思路。

為了進一步提升性能，研究團隊對ThermoCas9進行定向進化，獲得了一個增強型突變體，并且，通過采用mRNA或核糖核蛋白（RNP）遞送ThermoCas9，與質粒遞送相比編輯效率顯著提高，為后續臨床轉化提供了技術基礎。

在應用層面，研究團隊測試了ThermoCas9靶向乳腺癌細胞中低甲基化基因的效果。在乳腺癌細胞中，由于DNA甲基化的缺失導致的ESR1過表達是常見的靶向治療位點。通過對MCF-7（癌細胞）和MCF-10A（正常細胞）細胞基因組進行甲基化EPIC芯片分析，研究團隊選擇了數個存在甲基化差異性的靶點。利用增強型突變ThermoCas9 進行靶向編輯后，癌細胞中的目標位點被成功編輯，且編輯效率達25%~78%。而在正常細胞中的編輯水平與其甲基化水平相符，顯著低于癌細胞。

討論與展望：開啟“表觀遺傳感知型CRISPR”的新方向

綜合生化實驗、結構解析與細胞功能驗證，該研究證明：ThermoCas9可識別5′-NNNNCNR-3’ PAM序列，而當5位胞嘧啶甲基化（5mC）時，其活性在體外及人類細胞中均被顯著抑制。

這項研究最核心的意義在于，Cas9不再只是“識別基因序列”，而開始能夠“感知表觀遺傳學狀態”。ThermoCas9所帶來的，是一種基于表觀遺傳信息的選擇性編輯能力：它可以根據DNA的甲基化狀態決定是否進行切割，從全新的維度實現更精細的調控與更精準的靶向治療。

https://www.nature.com/articles/s41586-026-10384-z

制版人： 十一

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