Science丨Src激酶通過胞吐作用來到腫瘤細胞表面成為抗體治療新靶點

撰文丨章臺柳

癌癥靶向抗體療法通常要求蛋白質水平的顯著上調，或者產生一個全新的表位——例如源自基因突變或異常的翻譯后修飾。研究顯示，蛋白質錯誤定位使得細胞內蛋白能夠通過某種未知機制易位至細胞表面，使其成為 可靶向 的位點，挑戰了“只有經典分泌型或膜結合型靶點才適合作為免疫治療候選對象”的傳統范式。

越來越多的證據表明，某些蛋白激酶會被分泌至細胞外空間，并發揮功能。理論上，這些胞外激酶有可能在腫瘤微環境中過度磷酸化細胞外蛋白，因為腫瘤微環境中細胞外 ATP 豐度極高（高達 1mM ），遠超激酶典型的米氏常數（ Km ，對底物的親和力）；而正常組織中的 ATP 水平約為 1 0 nM 。例如，將 CK 2 與 anti - HER 融合使其靶向過表達 HER 2 的細胞，導致多種癌癥相關表面蛋白（包括 CD 44 、 Galectin -3 和 CD 109 ）發生磷酸化。那么，這種胞外激酶是否存在 于 腫瘤細胞表面？

近 日 ， 來自 UCSF 的 James A. Wells 團隊 在 Science 雜 志上發表文章 Autophagolysosomal exocytosis inverts Src kinase onto the cell surface in cancer ，發現Src激酶作為一種通常通過其N-豆蔻酰脂質錨定在質膜內葉的主調控激酶，在癌癥中（無論是體內還是體外）通過自噬溶酶體胞吐作用（ALE）均發生了非經典易位并翻轉至細胞表面，同時其他N-豆蔻酰化的細胞內蛋白也以類似的方式被易位。 此外，在 原發性腫瘤中 也 發現這種細胞外膜相關 Src （ eSrc ），并且基于抗 Src 抗體的療法在細胞培養系統和小鼠異種移植模型中均介導了腫瘤細胞的殺傷。因此，以Src為代表的細胞內N-豆蔻酰化蛋白，在癌癥中可以發生拓撲翻轉至細胞表面，并成為抗體療法的靶點。

研究人員 利用 更高分辨率的光鄰近標記蛋白質組學（PLP）技術，如 μMap 和 MultiMap ，用于觸發短程反應性生物素 - 卡賓標記， 來 描繪細胞表面蛋白質組。利用 PLP 技術，鑒定出 738 種表面蛋白，從中篩選出 28 種蛋白激酶。 其中包括與癌癥相關的酪氨酸激酶 Src ，以及其他 Src 家族激酶： Fyn 、 Yes 和 Lyn 。 雖然之前有報道在癌細胞系的培養基中發現分泌的 Src ，但 Src 存在于細胞表面的現象還未報道過。鑒于這些酪氨酸激酶的存在，使用癌細胞系 HCC 1569 檢測細胞表面是否會發生酪氨酸磷酸化。使用流式細胞術檢測出細胞表面具有抗磷酸酪氨酸（ anti - pY ）信號，使用 Src 抑制劑可顯著降低 anti - pY 信號。此外在表面蛋白質組學檢測到的 Src 家族激酶中， Src 在 HCC 1569 細胞中的轉錄水平最高。 同時鑒定出細胞表面存在 Src 激酶底物，使用重組 Src 激酶結構域處理 HCC 1569 細胞可導致細胞增殖增加，表明 Src 介導的細胞外 pY 磷酸化會對細胞產生功能影響 。 細胞 質 Src （ cSrc ）通常通過其 N 端豆蔻酰化脂質錨定在質膜的內葉 。為了確定胞外 Src （ eSrc ）的定位，使用 anti - Src 抗體來檢測細胞表面和培養基，發現在培養基中并未檢測到 Src ，而在細胞表面有強表達的 Src ， 這表明 cSrc 發生了明顯的翻轉，從質膜內葉轉移到了細胞表面。 對 多種癌癥來源細胞系、健康組織的永生化模型、健康供體來源的外周血單個核細胞（PBMCs）、健康人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）以及健康原代膀胱上皮細胞（BdECs） 檢測 eSrc 細胞表面表達，發現 大多數測試的永生化細胞系均表達 eSrc ； 而在健康供體的 PBMCs 、 HUVECs 或 BdECs 上則未檢測到 eSrc ，雖然細胞內含有非常高水平的 cSrc 。在永生化及癌細胞系中， eSrc 的表達與總 Src 蛋白表達高度相關，但在健康的 HUVECs 和 BdECs 中未觀察到這種趨勢。搜集臨床腫瘤樣本，發現在 1 0 例原發性膀胱腫瘤的活腫瘤細胞均表達 eSrc 。

那么， Src 如何轉移至細胞表面？ 研究發現，在 自噬體生物發生過程中，來自質膜的 cSrc （或來自細胞質新近 N- 豆蔻酰化的 cSrc ）在自噬體閉合前會出現在其兩側；這些自噬體隨后被運輸并與溶酶體融合，導致 Src 位于自噬溶酶體的內葉。隨后，通過溶酶體胞吐作用， eSrc 與其他溶酶體標記物一起展示在質膜上。 其中 N - 豆蔻酰基團 可介導 Src 與自噬體的結合。同時，研究人員對其他 N- 豆蔻酰 化蛋白進行檢測，在細胞表面鑒定出 3 4 種已知的 豆蔻酰 化蛋白，其中大多數尚未被注釋為胞外蛋白。通過活細胞流式細胞術獨立驗證了其中三種位于內葉的 N- 豆蔻酰化蛋白（ Lyn 、 MARCKS 和 OAS2 ）確實存在于細胞表面 。即 N- 豆蔻酰化蛋白 可以通過 自噬溶酶體胞吐作用 的機制被非經典地展示在細胞外 。

腫瘤細胞中 Src 表達會增加，同時自噬溶酶體胞吐作用介導 eSrc 易位，這提示 eSrc 可能是一種潛在的腫瘤特異性抗原。研究人員利用 Fab 噬菌體文庫分離出一種針對人 Src 激酶結構域的重組抗體（ Ab 1 ）， Ab 1 能結合表達 eSrc 的細胞，這種結合是特異性的。 進一步表征顯示， Ab 1 在荷瘤小鼠體內循環過程中，在腫瘤中高度定位。隨后研究人員嘗試將 Ab 1 工程化為多種治療形式，來評估 eSrc 作為靶點的可及性和療效。將放射性同位素（如發射 α 粒子的 225 Ac ）通過螯合劑偶聯到抗體上，可能作為一種放射配體療法（ RLT ）實現強效殺傷，因為每個細胞只需少數幾次 α 粒子發射即可產生細胞毒性。在 HT-1080 荷瘤小鼠中，劑量僅為 0.6μCi 的 225 Ac 即可導致 腫瘤消退（ 16 只中有 2 只）或腫瘤生長速率的大幅降低（ 16 只中有 14 只）。初次給藥未觀察到急性毒性或體重減輕；然而，后續劑量觀察到了肝臟毒性，這與已知的小鼠一般輻射耐受性一致 。 通過將 Ab 1 的 Fab 片段與 CD 3 結合臂進行融合構建了雙特異性抗體，來評估 eSrc 作為 T 細胞銜接器（ TCE ）靶點的潛力。體內和體外的檢測顯示，抗 Src - TCE 顯著抑制腫瘤生長。由于 eSrc 缺乏內吞途徑，其不適合作為 ADC 藥物開 發的靶點。即 eSrc 是一個基于抗體療法（特別是 TCE 和 RLT ）的具有治療相關性的靶點。

總的來說，這項研究揭示了以Src為代表的細胞內N-豆蔻酰化蛋白，在癌癥細胞中通過自噬溶酶體胞吐作用發生非經典易位并翻轉至細胞表面。同時鑒定出eSrc可作為癌癥靶向抗體療法的靶點。

https://doi.org/10.1126/science.aec1778

制版人： 十一

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