Redox Biol I 天然異黃酮破解心肌肥厚：鳶尾黃素阻斷MCL1泛素化，重塑線粒體穩態 (陳曉強/李穗吉-廈門大學附屬心血管病醫院)

2025年9月2日，廈門大學附屬心血管病醫院/廈門大學醫學院陳曉強、李穗吉團隊 聯合上海交通大學醫學院附屬上海市第一人民醫院蔡利棟、楊文藝團隊，在Redox Biology（中科院1區，IF=11.9）在線發表題為 “Tectorigenin attenuates cardiac hypertrophy via USP9X/MCL1-mediated mitochondrial stabilization” 的研究論文。該研究聚焦病理性心肌肥厚及其向心力衰竭進展這一心血管疾病關鍵問題，圍繞天然異黃酮類化合物鳶尾黃素（Tectorigenin，Tec）改善心肌肥厚、線粒體功能障礙和心臟病理性重構的作用及機制展開系統研究。

研究團隊采用橫主動脈縮窄術（TAC）構建壓力負荷誘導的心肌肥厚小鼠模型，并結合苯腎上腺素（PE）誘導的新生大鼠心肌細胞肥大模型，從體內外兩個層面驗證 Tec 的心臟保護作用。結果顯示，Tec 可顯著提高 TAC 小鼠生存率，改善左心室射血分數和短軸縮短率，降低心臟和肺組織負荷，減輕心肌細胞肥大、心肌纖維化及病理性重構，并下調 ANP、BNP、α-SMA、Col1α 和 CTGF 等肥厚/纖維化相關標志物。

機制上，該研究發現，Tec 的核心保護作用并非依賴傳統 PI3K-AKT 存活信號通路，而是通過穩定 MCL1 這一線粒體完整性關鍵調控因子發揮作用。肥厚刺激會促進 MCL1 泛素化及蛋白酶體降解，導致線粒體結構破壞、氧化應激增強和能量代謝障礙；Tec 則可通過增強去泛素化酶 USP9X 與 MCL1 的相互作用，減少 MCL1 泛素化降解，維持 MCL1 蛋白穩定。

進一步研究顯示，Tec 可保護線粒體超微結構，減少線粒體碎片化和腫脹，恢復線粒體嵴完整性，提高線粒體復合物 I–V 活性、ATP 生成能力和氧耗水平，同時降低 ROS 水平并增強 SOD、MnSOD、GSH/GSSG 等抗氧化防御。無論在體外心肌細胞還是體內 TAC 小鼠中，敲低 MCL1 或 USP9X 均會削弱甚至消除 Tec 的抗心肌肥厚、抗氧化和線粒體保護效應，證明 USP9X-MCL1-線粒體穩態軸 是 Tec 發揮心臟保護作用的關鍵通路。

該研究系統闡明了鳶尾黃素通過 “增強 USP9X-MCL1 相互作用—抑制 MCL1 泛素化降解—穩定線粒體功能—阻斷心肌肥厚與纖維化重構” 改善病理性心肌肥厚的新機制，為天然活性成分干預心肌肥厚及心力衰竭提供了新的實驗依據，也為開發靶向線粒體穩態和蛋白去泛素化調控的心血管疾病治療策略提供了重要參考。

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【摘要】

病理性心肌肥厚由線粒體功能障礙和適應不良性心臟重構驅動，目前仍是治療上的重要挑戰。本研究探討了鳶尾黃素（tectorigenin，Tec）在橫主動脈縮窄術（transverse aortic constriction，TAC）誘導心肌肥厚中的心臟保護作用，并重點關注其對線粒體穩態的影響。

在動物模型中，Tec 給藥可提高 TAC 小鼠生存率，改善心功能障礙，減輕心肌肥厚和纖維化，并保護線粒體功能。體外實驗顯示，Tec 可抑制苯腎上腺素（phenylephrine，PE）誘導的心肌細胞增大和線粒體損傷。

機制研究表明，Tec 可通過 USP9X 促進 MCL1 去泛素化，從而穩定 MCL1 這一線粒體完整性關鍵調控因子，防止其降解，并且該作用不依賴 PI3K-AKT 信號通路。值得注意的是，沉默 MCL1 或 USP9X 均可抵消 Tec 的抗心肌肥厚和抗氧化作用，說明二者在 Tec 發揮保護作用過程中具有關鍵作用。

這些發現表明，Tec 是一種新的 USP9X-MCL1-線粒體軸 調節因子，為將病理性心臟重構與線粒體功能障礙分離提供了新的治療思路。通過繞開傳統細胞存活通路，Tec 代表了一種以線粒體為核心的策略，可延緩心力衰竭進展，并將天然化合物藥理學與靶向細胞器穩態調控相聯系。

關鍵詞：病理性心肌肥厚；線粒體功能障礙；鳶尾黃素；MCL1；泛素化

01

研究背景及科學問題

心肌肥厚最初是機體對長期壓力負荷的一種適應性反應，但隨后可能發展為病理性重構和心力衰竭，是全球發病率和死亡率的重要貢獻因素。該病理過程以心肌細胞增大和組織結構改變為主要特征，最終導致心功能受損，并增加嚴重心血管事件風險。

盡管目前在心肌肥厚治療方面已有一定進展，例如使用血管緊張素轉換酶抑制劑和 β 受體阻滯劑等，但現有治療仍難以有效逆轉病理性心臟重構，也無法充分干預其深層機制。現有療法療效有限且存在一定副作用，因此亟需開發新的干預策略，尤其是能夠恢復心臟穩態的靶向藥物。

線粒體在心臟能量產生中發揮核心作用，其功能障礙已被認為是病理性心肌肥厚的關鍵因素。線粒體約占心肌細胞體積的 30%，是通過氧化磷酸化產生 ATP 的主要場所，對維持心肌收縮功能至關重要。同時，線粒體還參與鈣穩態調節、氧化還原平衡維持和細胞凋亡控制，這些過程均對心臟健康十分重要。

在病理性心肌肥厚過程中，線粒體結構、能量生成和動力學均會發生明顯紊亂，包括線粒體網絡碎片化、ATP 合成減少和活性氧（ROS）生成增加。這些改變共同加重心肌損傷，并加速心力衰竭進展。盡管改善線粒體質量控制的策略，如增強線粒體自噬或調節線粒體融合/分裂過程，已顯示一定潛力，但連接線粒體功能障礙與心肌肥厚進展的確切機制仍未完全明確。

鳶尾黃素（Tectorigenin，Tec）是一種來源于植物的天然異黃酮，因具有多種生物活性而受到關注，包括抗氧化、抗炎和心臟保護作用。在心血管領域，Tec 已被報道可改善內皮功能、降低氧化應激并抑制心臟纖維化。近期研究提示，Tec 可能通過調節線粒體功能發揮保護作用，例如穩定線粒體膜電位、減少 ROS 生成和改善代謝紊亂。然而，Tec 在病理性心肌肥厚中的具體作用及其靶向線粒體的機制尚未得到充分研究。

PI3K-AKT 通路長期以來被認為在心臟中具有促進細胞存活和參與病理性信號轉導的雙重作用，尤其在心肌肥厚背景下，其作用可能因具體環境而異。近期研究強調，MCL1 是 PI3K-AKT 通路下游的重要效應因子，也是連接線粒體動力學、代謝適應和心肌肥厚的關鍵節點。

MCL1 是 BCL-2 蛋白家族中的抗凋亡成員，在維持線粒體完整性方面發揮重要作用。其作用包括穩定線粒體膜電位以增強 ATP 合成、與線粒體分裂和融合調控因子協作調節線粒體動力學、通過線粒體自噬降解通路促進選擇性線粒體更新等。在心臟疾病中，MCL1 缺失會破壞線粒體完整性和功能，導致能量代謝紊亂并加重肥厚性重構，說明其對維持心肌細胞健康具有關鍵意義。

鑒于 Tec 具有潛在心臟保護作用，本研究進一步探討 Tec 是否能夠通過影響 MCL1 及其對線粒體功能的調控來減輕病理性心肌肥厚。這一研究不僅有助于闡明 Tec 的作用機制，也可能為在心臟重構過程中保護線粒體健康提供新的治療策略。

本研究以 TAC 誘導的心肌肥厚為模型，重點探討 Tec 的治療效果及其與 MCL1 穩定性和線粒體功能維持之間的關系。研究結果顯示，Tec 可通過保護線粒體健康、恢復 ROS 平衡、降低心肌肥厚標志物表達來改善心臟病理改變。機制上，Tec 通過 USP9X 介導的去泛素化過程增強 MCL1 穩定性，并且這一過程獨立于傳統 PI3K-AKT 信號通路。上述發現提示，Tec 是一種有前景的線粒體功能障礙靶向干預候選物，并揭示 USP9X-MCL1 軸可能成為治療心肌肥厚的新策略。

02

重要發現及亮點

1. Tec 改善 TAC 誘導心肌肥厚小鼠的心功能障礙和病理性重構

研究首先選擇具有富含羥基結構的小分子化合物 Tec 進行藥理學評價。為探索 Tec 治療病理性心肌肥厚的潛力，研究建立 TAC 小鼠模型，并給予 Tec 75 mg/kg 口服給藥，每兩天一次，持續 4 周。該劑量此前已在小鼠系統中驗證具有安全性。

結果顯示，與未治療 TAC 小鼠相比，Tec 干預顯著提高 TAC 小鼠生存率。超聲心動圖分析顯示，TAC 手術導致小鼠心功能明顯惡化，而 Tec 治療小鼠心功能得到明顯保護，表現為左心室射血分數（LVEF）升高、左心室短軸縮短率（LVFS）改善，同時左心室收縮末期內徑（LVIDs）和舒張末期內徑（LVIDd）降低。

此外，大體形態分析顯示，與 TAC 對照組相比，Tec 處理小鼠心臟和肺組織體積減少，心重/脛骨長度比（HW/TL）和肺重/脛骨長度比（LW/TL）顯著降低。HE 染色進一步證實，與 TAC 小鼠相比，Tec 干預組左心室腔擴張和病理性心肌重構明顯減輕。整體而言，這些結果表明 Tec 給藥可有效緩解 TAC 誘導的心功能障礙，并提高小鼠生存率。

隨后，研究從組織學和分子水平進一步評估 Tec 對心肌重構，尤其是心肌肥厚和纖維化的影響。WGA 染色顯示，與對照組相比，TAC 小鼠心肌細胞明顯增大，而 Tec 處理可顯著逆轉這一變化。α-SMA 免疫熒光強度和 Masson 三色染色顯示，Tec 可顯著降低心臟組織纖維化程度和膠原沉積。Masson 染色還顯示，Tec 可改善 TAC 誘導的肌原纖維排列紊亂，并減少病理性肌纖維間隙。

與上述病理學結果一致，Tec 處理后，纖維化相關標志物 α-SMA、Col1α 和 CTGF，以及心肌肥厚相關基因 ANP 和 BNP 的轉錄水平和蛋白表達均顯著低于未治療 TAC 小鼠�？傮w來看，Tec 可有效減輕 TAC 誘導的病理性心肌重構，包括心肌肥厚和纖維化。

圖1 Tec 治療改善 TAC 誘導小鼠模型中的心功能障礙并提高生存率。
A：Tec 化合物的化學結構；
B：實驗設計：8 周齡雄性小鼠接受假手術或橫主動脈縮窄術（TAC），隨后給予 Tec（75 mg/kg，每兩天一次，灌胃）或生理鹽水治療 4 周；
C：TAC 組與 TAC+Tec 組生存曲線比較，n=16；
D：代表性超聲心動圖圖像，比較各組心臟結構；
E–H：心功能參數，包括左心室射血分數（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）、左心室收縮末期內徑（LVIDs）和舒張末期內徑（LVIDd），n=5；
I–J：不同組心臟大體形態圖像及心重/脛骨長度（HW/TL）比值，n=6；
K–L：不同組肺組織大體形態圖像及肺重/脛骨長度（LW/TL）比值，n=6；
M：HE 染色心臟組織切片。
Veh：vehicle，*p<0.05，***p<0.001。

圖2 Tec 治療減輕 TAC 誘導的心肌肥厚、纖維化及病理基因表達。
A：各實驗組心肌細胞形態的 WGA 染色；
B：WGA 染色圖像中心肌細胞橫截面積定量，n=120，n 表示細胞數量；
C：α-SMA 免疫熒光染色，顯示平滑肌細胞分布；
D：α-SMA 熒光強度統計分析，n=5；
E：Masson 三色染色顯示心肌纖維化；
F：E 圖中纖維化面積百分比定量，n=5；
G–K：α-SMA、Col1a、CTGF、ANP 和 BNP 的 mRNA 表達水平，歸一化至對照組，n=6；
L：Western blot 檢測 ANP、BNP 和 β-tubulin 蛋白表達，其中 β-tubulin 作為內參。
Veh：vehicle，***p<0.001。

2. 體外藥理學驗證 Tec 抗心肌細胞肥大的治療潛力

為研究 Tec 對心肌細胞增大的影響，研究開展了一系列體外實驗。首先采用 CCK-8 法檢測細胞活力，結果顯示，新生大鼠心肌細胞（NRCMs）在 Tec 濃度不超過 20 μM 時仍保持良好活性；而當 Tec 濃度超過該閾值，即 40–80 μM 時，細胞毒性顯著增加。進一步時間梯度分析顯示，20 μM Tec 在 72 h 內不會影響細胞活力。

隨后，為評估 Tec 對心肌肥厚的抑制作用，研究采用苯腎上腺素（PE）誘導 NRCMs 肥大，并聯合 20 μM Tec 處理 36 h。結果顯示，Tec 聯合處理顯著降低 PE 誘導的心肌肥厚標志物 ANP 和 BNP 上調，并且這種降低同時體現在 mRNA 和蛋白水平。α-actinin 免疫熒光染色及定量分析進一步顯示，Tec 可有效緩解 PE 誘導的心肌細胞面積增大。

總體而言，這些結果表明，Tec 可通過抑制肥厚相關基因表達和減少細胞體積增大來減輕 PE 誘導的心肌細胞肥大，提示其具有治療心肌肥厚的潛力。

圖3 Tec 對 PE 誘導心肌細胞肥大的抑制作用。
A：新生大鼠心肌細胞經 0、5、20 和 80 μM Tec 處理 24 h 后，采用 CCK-8 法檢測細胞活力，n=4；
B：心肌細胞經 Tec（20 μM）處理不同時間點（0–72 h）后的細胞活力，n=4；
C–G：NRCMs 經苯腎上腺素（PE，10 μM）和 Tec（20 μM）處理 36 h，以研究 Tec 對 PE 誘導心肌細胞肥大的影響；
C–D：心肌肥厚相關基因 ANP 和 BNP 的相對 mRNA 表達水平，n=5；
E：Western blot 檢測 ANP 和 BNP 蛋白表達；
F：NRCMs 的 α-actinin 免疫熒光染色，綠色顯示 α-actinin，用于定量細胞大��；細胞核以 DAPI 藍色復染；
G：α-actinin 染色圖像中心肌細胞橫截面積定量，n=5。
Veh：vehicle，***p<0.001。

3. Tec 保護線粒體完整性并恢復氧化還原穩態，從而減輕心肌肥厚

心臟富含線粒體，并高度依賴線粒體進行能量代謝和維持正常功能。已有研究顯示，線粒體功能障礙在病理性心肌肥厚中發揮重要作用。為探討 Tec 對線粒體的調控作用，研究將 GeneCard 數據庫中的心肌肥厚相關基因與 SwissTargetPrediction 預測的 Tec 靶蛋白取交集，獲得 77 個潛在重疊靶點。GO 分析顯示，這些靶點富集于氧化應激反應和脂質代謝相關通路，提示 Tec 可能影響維持線粒體健康和氧化還原平衡的關鍵過程。

透射電鏡結果顯示，Tec 可恢復 TAC 破壞的線粒體結構，表現為碎片化線粒體減少、線粒體密度增加，并逆轉線粒體腫脹，即線粒體中位面積和形態不規則程度降低。進一步形態計量分析顯示，Tec 顯著恢復線粒體嵴完整性，增加每個線粒體中的嵴數量，并改善肌原纖維連續性，提示其可緩解病理性心臟重構。

同時，Tec 可減輕氧化應激，表現為 DHE 熒光和線粒體超氧陰離子 MitoSOX 水平均下降。機制上，Tec 增強了線粒體抗氧化能力，使 MnSOD 活性顯著升高，同時總 SOD 活性、谷胱甘肽（GSH）水平和 GSH/GSSG 比值也升高，提示細胞整體抗氧化防御能力得到增強。

關鍵的是，Tec 可恢復線粒體呼吸功能，在壓力負荷處理的心肌細胞中保護基礎呼吸、ATP 生成能力和最大呼吸能力。線粒體復合物 I–V 活性檢測進一步證實，Tec 可糾正 TAC 誘導的電子傳遞鏈功能障礙。心臟組織 ATP 含量升高也進一步支持 Tec 可改善生物能量代謝。綜上，Tec 通過保護線粒體超微結構、恢復呼吸鏈功能并增強氧化還原穩態發揮心臟保護作用。

圖4 Tec 通過改善線粒體功能和降低氧化應激，對心肌肥厚發揮保護作用。
A：Venn 圖顯示 GeneCard 數據庫檢索的心肌肥厚相關基因與 SwissTargetPrediction 預測的 Tec 靶蛋白之間的重疊；
B：77 個重疊基因相關生物過程（BP）的 GO 分析；
C：小鼠心臟組織透射電鏡圖像，顯示線粒體形態。上圖為低倍圖，粉色區域標出解體線粒體；下圖為上圖所示區域的放大圖；
D–F：每高倍視野（HPF）中解體線粒體數量、心臟組織線粒體密度，以及 TEM 圖像中心臟組織線粒體面積的定量分析；
G：DHE 染色顯示心臟組織氧化應激；
H：DHE 熒光強度定量，n=6；
I：MitoSOX 染色顯示對照或 PE 條件下，經 vehicle 或 Tec 處理心肌細胞中的線粒體超氧陰離子水平；
J：MitoSOX 熒光強度定量，n=5；
K：小鼠心臟組織 MnSOD 酶活性定量，n=5；
L：心肌細胞氧耗率（OCR）代表性曲線。Oligo：寡霉素；Rot/AA：魚藤酮/抗霉素 A；
M–O：心肌細胞基礎呼吸、ATP 生成和最大呼吸定量，n=4。
*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

4. Tec 通過 PI3K-AKT 非依賴性蛋白酶體降解通路，穩定 MCL1 并抑制其泛素化依賴性降解

為探索 Tec 如何調控線粒體穩態，研究對 77 個重疊候選基因進行 KEGG 通路分析，發現其中 11 個基因與 PI3K 信號通路相關，提示 PI3K 通路可能參與 Tec 的心臟保護作用�？紤]到 PI3K-AKT 通路在病理性心肌肥厚中的重要性，研究進一步分析 Tec 與該通路的關系。

研究構建蛋白-蛋白相互作用網絡，并利用 Cytoscape 中的 CentiScape 識別出 22 個樞紐基因，其中 6 個也屬于 PI3K 通路成分。分子對接模擬顯示，MCL1 與 Tec 具有最高親和力，即結合能最低。MCL1 是維持線粒體完整性和抗凋亡的重要調節因子。

功能實驗顯示，PE 刺激導致心肌細胞中 MCL1 轉錄水平降低，并增加 AKT 磷酸化，但 Tec 治療并不影響這些變化。重要的是，Tec 可顯著阻止 PE 誘導的 MCL1 蛋白耗竭，提示 Tec 是在轉錄后水平穩定 MCL1，并且這一機制不依賴 PI3K-AKT 通路。

進一步時間梯度實驗顯示，在 PE 應激下，MCL1 蛋白降解加速，而 Tec 治療顯著減緩該過程。蛋白酶體抑制劑 MG132 可恢復 PE 處理細胞中的 MCL1 水平，而溶酶體抑制劑羥氯喹（HCQ）不能恢復，說明蛋白酶體降解是主要途徑。Tec 對 MCL1 的保護作用與 MG132 類似，可有效抵消 PE 誘導的 MCL1 丟失。

此外，PE 處理可劑量依賴性增強 MCL1 泛素化，而 Tec 顯著降低 MCL1 泛素化水平。綜合來看，這些結果提示，Tec 可能通過抑制泛素化依賴性蛋白酶體降解來穩定 MCL1，從而緩解心肌肥厚，并且該效應獨立于 PI3K-AKT 信號通路。

圖5 Tec 通過泛素化降解途徑有效調控 MCL1 穩定性。
A：77 個重疊基因的 KEGG 通路分析，突出顯示 11 個與 PI3K 信號通路相關的基因；
B：重疊基因蛋白-蛋白相互作用網絡，顏色越深表示基因連接度越高；
C：通過 Cytoscape 中的 CentiScape 識別 22 個樞紐基因，并與 PI3K 通路基因取交集得到 6 個重疊基因。Tec 與這些基因的分子對接分析顯示 MCL1 結合能最低；
D：Tec 與 MCL1 的分子對接圖；
E：不同處理條件下心肌細胞中 MCL1 mRNA 水平，n=5；
F–H：Western blot 分析 AKT 磷酸化和 MCL1 蛋白表達，n=3；
I–J：在對照或 PE 條件下，經環己酰亞胺（CHX，100 μg/mL）處理后心肌細胞中 MCL1 蛋白水平的時間依賴性變化，n=3；
K–L：在 PE 或 PE+Tec 條件下，經 CHX 處理后心肌細胞中 MCL1 蛋白水平的時間依賴性變化，n=3；
M：PE 刺激心肌細胞中，溶酶體抑制劑羥氯喹（HCQ，50 μM）和蛋白酶體抑制劑 MG132（10 μM）處理 24 h 對 MCL1 蛋白表達的影響及統計分析，n=3；
N：不同處理條件下心肌細胞中 MCL1 蛋白表達及統計分析，n=3；
O：不同 PE 濃度下 MCL1 蛋白泛素化水平；
P：不同處理條件下心肌細胞中 MCL1 泛素化狀態。
Veh：vehicle，*p<0.05，***p<0.001，ns：無顯著差異。

5. Tec 增強 USP9X-MCL1 分子相互作用，從而減輕泛素化依賴性蛋白酶體降解

為明確 Tec 如何影響 MCL1 的泛素化介導降解，研究關注 USP9X。USP9X 是一種去泛素化酶，已知可通過抑制 MCL1 的蛋白酶體降解來穩定 MCL1。研究推測，Tec 可能通過調節 USP9X 與 MCL1 的結合來影響 MCL1 泛素化。

共免疫沉淀實驗確認，在心肌細胞中內源性 MCL1 與 USP9X 存在相互作用；在 293T 細胞中，采用 HA 標記 MCL1 和 Flag 標記 USP9X 也進一步驗證了二者相互作用。免疫熒光顯微鏡顯示，MCL1 和 USP9X 在心肌細胞胞質中共定位，進一步支持二者存在物理關聯。

鑒于 USP9X 在穩定 MCL1 中的核心作用，以及二者共定位現象，研究進一步推測 Tec 可能直接與 USP9X 結合。分子對接分析預測 Tec 與 USP9X 存在直接相互作用。為實驗驗證 Tec 的結合伙伴，研究采用生物素化 Tec 探針，并預先與鏈霉親和素磁珠孵育，再從心肌細胞裂解液中拉下與 Tec 相互作用的蛋白。Western blot 分析顯示，Tec 可與 USP9X 和 MCL1 相互作用，提示 Tec 可能作為分子橋梁促進 USP9X-MCL1 相互作用。

進一步實驗顯示，PE 刺激或 Tec 處理均不影響 USP9X mRNA 水平；Western blot 也證實，在體外 PE 誘導和體內 TAC 誘導的肥厚模型中，Tec 干預后 USP9X 蛋白表達保持穩定。為增強研究在人源細胞模型中的轉化價值，研究在 AC16 人心肌細胞中檢測 Tec 作用。結果顯示，Tec 可顯著抵消 AngII 誘導的 MCL1 蛋白下調，而 USP9X 蛋白水平保持不變。

值得注意的是，PE 或 AngII 單獨刺激會明顯削弱心肌細胞中 USP9X-MCL1 相互作用；但在相同病理條件下，Tec 處理可強烈增強這一蛋白復合物形成。進一步研究顯示，敲低 USP9X 會消除 Tec 穩定 MCL1 蛋白的能力。Co-IP 分析還顯示，Tec 可降低 PE 誘導的 MCL1 泛素化，而 USP9X 沉默可逆轉該作用。

綜上，這些結果表明，Tec 通過增強 MCL1 與 USP9X 的相互作用，減少 MCL1 泛素化依賴性降解。

圖6 Tec 通過調節 MCL1-USP9X 相互作用影響 MCL1 的泛素化降解。
A–B：共免疫沉淀分析顯示心肌細胞中 MCL1 與 USP9X 的相互作用；
C–D：在 293T 細胞中驗證 HA 標記 MCL1 與 Flag 標記 USP9X 之間的相互作用；
E：心肌細胞免疫熒光顯微圖像。DAPI 藍色顯示細胞核，USP9X 綠色，MCL1 紅色，合并圖顯示二者共定位；
F：Tec 與 USP9X 的分子對接圖；
G：體外實驗示意圖，用于檢測與 Tec 相互作用的蛋白。生物素化 Tec 探針預先與鏈霉親和素磁珠孵育，再與心肌細胞裂解液孵育，隨后洗脫結合復合物用于檢測；
H：Western blot 檢測 USP9X、MCL1 與 Tec 探針的相互作用；
I：不同處理組心肌細胞中 USP9X mRNA 表達水平，n=5；
J–L：Western blot 分析體內和體外肥厚模型中 Tec 處理后 USP9X 表達，并對 USP9X 蛋白水平進行 β-tubulin 歸一化定量，n=4；
M：Western blot 分析 AC16 人心肌細胞經 Tec（20 μM）和/或 AngII（1 μM）處理后的 USP9X 和 MCL1 蛋白；
N–O：對 M 圖中 MCL1 和 USP9X 相對蛋白表達進行定量，n=3；
P–Q：在 MG132 介導的蛋白酶體抑制條件下，心肌細胞經 10 μM PE 或 1 μM AngII 處理 36 h，并有或無 Tec（20 μM）干預，采用 Co-IP 分析 MCL1 與 USP9X 相互作用；
R–S：USP9X 敲低心肌細胞經 10 μM PE 和/或 Tec 處理 36 h 后，Western blot 分析 MCL1 蛋白水平，n=3；
T：Co-IP 分析心肌細胞中 MCL1 的泛素化水平。
***p<0.001，ns：無顯著差異。

6. Tec 通過 MCL1 介導的抗心肌肥厚和抗氧化應激作用發揮心臟保護效應

為研究 Tec 是否通過 MCL1 依賴性機制對肥厚性心肌病發揮保護作用，研究在 MCL1 沉默的 NRCMs 中進行 PE 應激實驗。結果顯示，Tec 可顯著降低 PE 誘導的心肌肥厚標志物升高，但 MCL1 沉默會抵消 Tec 的治療效應。

免疫熒光定量進一步顯示，Tec 可有效緩解 PE 誘導的細胞增大，而 MCL1 缺失會逆轉這一作用。線粒體氧化還原分析顯示，Tec 可成功降低 PE 誘導的心肌細胞 ROS 過度生成，表現為 MitoSOX 熒光強度下降；但在 MCL1 敲低后，這一保護作用消失。

此外，MCL1 敲低還顯著消除了 Tec 增強細胞抗氧化能力的作用，包括提高 SOD 活性、增加 GSH 水平以及恢復 GSH/GSSG 比值。為直接評估線粒體能量代謝的功能后果，研究檢測了細胞氧耗率（OCR）。結果顯示，在 PE 挑戰下，Tec 可大體維持線粒體呼吸功能，包括基礎呼吸、ATP 生成和最大呼吸；然而，MCL1 沉默完全消除了 Tec 維持線粒體生物能量代謝的能力。

綜上，這些結果強調，MCL1 在 Tec 抵抗心肌肥厚、氧化應激以及線粒體功能障礙中具有必不可少的作用。

圖7 Tec 通過調控 MCL1 保護心肌細胞免受肥厚刺激誘導的線粒體功能障礙和心肌細胞肥大。
新生大鼠心肌細胞在存在或不存在 MCL1 敲低和 Tec 處理的條件下接受 PE 處理 48 h。
A–B：不同處理條件下 ANP 和 BNP mRNA 水平，n=5；
C：Western blot 顯示 ANP、BNP 和 MCL1 蛋白水平；
D–E：α-actinin 標記心肌細胞的免疫熒光圖像及心肌細胞橫截面積定量，n=5；
F–G：采用 MitoSOX 染色顯示心肌細胞線粒體 ROS 水平，并進行熒光強度定量，n=5；
H–J：不同實驗條件下檢測超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）水平，以及還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽比值（GSH/GSSG），n=5；
K：心肌細胞 OCR 代表性曲線。Oligo：寡霉素；Rot/AA：魚藤酮/抗霉素 A；
L–N：心肌細胞基礎呼吸、ATP 生成和最大呼吸定量，n=4。
*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

7. Tec 通過 USP9X 介導的 MCL1 穩定發揮抗心肌肥厚作用

基于 Tec 通過增強 USP9X 介導的去泛素化抑制 MCL1 泛素化、從而穩定 MCL1 的發現，研究進一步探討 USP9X 是否對 Tec 抵抗 PE 誘導心肌細胞肥厚至關重要。

在 PE 應激心肌細胞中，USP9X 敲低顯著消除了 Tec 對心肌肥厚標志物 ANP/BNP 的抑制作用，也消除了其逆轉細胞增大的能力。此外，PE 誘導的線粒體 ROS 積累可被 Tec 緩解，但 USP9X 缺失會恢復氧化應激水平，說明 USP9X 對線粒體保護具有核心作用。

USP9X 缺失還會消除 Tec 對 PE 誘導氧化還原穩態失衡的保護作用，表現為其不能恢復 SOD 活性、不能升高還原型 GSH 水平，也不能正�；� GSH/GSSG 比值。

總體而言，Tec 通過 USP9X 依賴性穩定 MCL1 來抵抗 PE 驅動的病理性重構，并協調發揮抗心肌肥厚和線粒體保護作用。

8. Tec 通過 MCL1 依賴性機制，對 TAC 誘導的病理性重構發揮多維度心臟保護作用

為明確 MCL1 在 Tec 體內心臟保護作用中的作用，研究通過尾靜脈注射 AAV9-cTnT 攜帶 MCL1 shRNA 或 scramble 對照，建立心肌細胞特異性 MCL1 敲低小鼠模型。RT-PCR 和 Western blot 結果確認 MCL1 抑制效率，證明模型構建成功。

隨后，TAC 手術小鼠每 48 h 腹腔注射 Tec 75 mg/kg，持續 4 周。Kaplan-Meier 分析顯示，與單純 TAC 組相比，Tec 顯著提高小鼠生存率，但這一獲益在 MCL1 敲低組中消失。超聲心動圖顯示，Tec 可通過提高 LVEF 和 LVFS、降低 LVIDs 來保護心功能，但這些效應在 MCL1 敲低小鼠中明顯減弱。

形態學和組織學評估進一步顯示，Tec 可減輕 TAC 誘導的 HW/TL 比值升高和心肌細胞橫截面積增加，而 MCL1 敲低可逆轉這些作用。此外，Tec 可在 mRNA 和蛋白水平下調心肌肥厚標志物 ANP/BNP，而 MCL1 抑制同樣會抵消該效應。綜上，Tec 主要通過 MCL1 依賴性通路緩解 TAC 誘導的心功能障礙和心肌肥厚。

在確定 MCL1 對 Tec 維持心功能至關重要之后，研究進一步考察其在心肌肥厚兩個關鍵病理特征——纖維化重構和線粒體失調——中的作用。免疫熒光分析顯示，Tec 可抑制 α-SMA 表達，而 MCL1 敲低會逆轉這一作用。Masson 三色染色顯示，Tec 可減少纖維化面積，并改善 TAC 誘導的肌原纖維排列紊亂、肌纖維間隙增大和組織完整性受損；但這些保護作用均被 MCL1 沉默抵消。

DHE 熒光定量顯示，Tec 可有效降低氧化應激，但 MCL1 缺失后這一保護作用消失；MnSOD 酶活性變化也支持這一結果。透射電鏡分析進一步顯示，MCL1 敲低消除了 Tec 對線粒體完整性的保護作用，包括抵消其增加線粒體密度、減少碎片化和緩解線粒體腫脹的效果。更關鍵的是，MCL1 缺失還阻斷 Tec 對線粒體嵴超微結構的恢復作用，使嵴嚴重程度評分和嵴密度改善均消失。

在結構改善的基礎上，研究進一步發現，Tec 恢復線粒體復合物 I–V 活性的作用完全依賴 MCL1，因為 MCL1 沉默可完全消除這一保護作用。這建立了一個直接因果鏈條：MCL1 同時介導線粒體結構完整性恢復和生物能量功能恢復。此外，Tec 對肌原纖維連續性的修復同樣依賴 MCL1，提示其可整體減輕病理性心臟重構。

這些數據共同證明，MCL1 是 Tec 在心肌肥厚中發揮抗纖維化和線粒體保護作用的核心調節因子，能夠協調從結構損傷恢復到氧化磷酸化功能改善的全過程。

圖8 Tec 通過調控 MCL1 減輕 TAC 誘導的心功能障礙和心肌肥厚。
心肌細胞特異性 MCL1 沉默小鼠及其野生型同窩對照小鼠接受 TAC 手術，以建立壓力負荷誘導的心肌肥厚模型。實驗組每隔一天灌胃給予 Tec（75 mg/kg），連續 4 周，隨后進行超聲心動圖功能評估和心肌組織形態學分析。
A：通過 RT-PCR 和 Western blot 確認 MCL1 敲低效率，n=5；
B：不同處理組小鼠 Kaplan-Meier 生存曲線，n=15；
C：小鼠心臟代表性超聲心動圖圖像；
D–G：超聲心動圖評估左心室射血分數（LVEF）、左心室短軸縮短率、左心室舒張末期內徑（LVIDd）和左心室收縮末期內徑（LVIDs），n=5；
H：心臟形態代表性圖像；
I：心重/脛骨長度（HW/TL）比值，n=5；
J：心臟組織 HE 染色代表圖像；
K–L：WGA 熒光染色顯示心肌細胞橫截面積代表圖像和定量分析，n=120，n 表示細胞數量；
M–N：小鼠心臟中 ANP 和 BNP 的相對 mRNA 表達水平，n=5；
O：Western blot 分析 ANP、BNP、MCL1 和 USP9X 蛋白水平。
*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns：無顯著差異。

圖9 Tec 減少心肌肥厚中的纖維化并改善線粒體功能。
A–B：小鼠心臟中 α-SMA 免疫熒光染色及平均熒光強度定量，n=5；
C–D：Masson 三色染色顯示心臟纖維化，并定量心臟組織纖維化面積，n=5；
E–F：DHE 熒光染色檢測氧化應激，并定量心臟組織熒光強度，n=5；
G–I：心臟組織透射電鏡代表圖像、線粒體密度定量、解體線粒體定量；
J：心臟組織線粒體面積定量；
K：線粒體嵴嚴重程度評分；
L：每個線粒體的嵴數量。
**p<0.01，***p<0.001。

【Citation】:Chen X, Zhou G, Yuan T, et al. Tectorigenin attenuates cardiac hypertrophy via USP9X/MCL1-mediated mitochondrial stabilization[J].Redox Biology,2025: 103855.

【貢獻】★★★★★

本研究證明，Tec 是一種具有多重心臟保護作用的天然化合物，可通過 USP9X 介導的 MCL1 去泛素化穩定線粒體功能，并抑制病理性心肌重構。

與傳統依賴 PI3K-AKT 信號通路的保護機制不同，Tec 可繞開 PI3K-AKT 通路，通過增強 USP9X-MCL1 相互作用，減少 MCL1 泛素化和蛋白酶體降解，從而維持 MCL1 蛋白穩定。MCL1 的穩定進一步保護線粒體結構完整性，恢復線粒體呼吸鏈功能，增強 ATP 生成，并降低氧化應激，最終減輕心肌肥厚、纖維化和心功能障礙。

圖10 所示機制總結為：肥厚刺激會破壞 MCL1-USP9X 相互作用，觸發 MCL1 泛素化介導的降解，進而導致線粒體功能障礙和病理性心肌細胞肥大，最終推動心力衰竭發生；而 Tec 可通過穩定 MCL1-USP9X 復合物、降低 MCL1 泛素化并保護線粒體完整性，從而減輕肥厚性損傷。

整體來看，本研究揭示了 “USP9X-MCL1-線粒體穩態” 是 Tec 抵抗病理性心肌肥厚的關鍵機制，為開發靶向 USP9X-MCL1 軸的心肌肥厚和心力衰竭治療策略提供了新的實驗依據。

圖10 機制示意圖。
肥厚刺激破壞 MCL1-USP9X 相互作用，觸發泛素化介導的 MCL1 降解。這會導致線粒體功能障礙和病理性心肌細胞肥大，最終進展為心力衰竭。Tec 可通過穩定 MCL1-USP9X 復合物、減少 MCL1 泛素化并保護線粒體完整性，從而減輕肥厚性損傷。

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