在園藝花卉植物的功能基因研究中，研究人員常常面臨諸多挑戰(zhàn)。農(nóng)桿菌介導對植物的遺傳轉(zhuǎn)化、基因表達及后續(xù)分子生化檢測等常取決于兩個關(guān)鍵因素：轉(zhuǎn)化效率以及目的基因在宿主中的正確表達與翻譯。這些方面往往難以準確觀察和評估，充分利用報告基因可以在一定程度上解決這些問題，從而提高園藝花卉功能基因研究和分子育種效率。

近日，上海師范大學明鳳團隊和深圳蘭科中心王志才等合作在Plant Physiology在線發(fā)表了題為Palette—a system for visualizing the expression levels of target genes in orchids的研究論文，開發(fā)了一套利用可視化報告基因RUBY監(jiān)測蘭花靶基因表達水平的“Palette”系統(tǒng)。

近年來，多項研究已報道了甜菜紅素報告基因RUBY在多種作物中的成功應(yīng)用。然而，RUBY在蘭科植物中的應(yīng)用和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化尚未見報道。研究團隊將RUBY基因與標簽蛋白結(jié)合，并選擇蘭科中最具代表性且商業(yè)價值最高的兩個屬——蝴蝶蘭（Phalaenopsis）和石斛蘭（Dendrobium）作為研究對象。通過監(jiān)測RUBY在蝴蝶蘭中的表達，研究人員成功實現(xiàn)了蛋白質(zhì)表達水平的可視化。團隊嘗試將功能基因PeMADS4與RUBY直接融合（MADS4-R），但在煙草葉片和蝴蝶蘭花瓣中均未觀察到顏色積累和目的蛋白的表達。為此，他們借鑒了RUBY的設(shè)計策略，在蛋白標簽和RUBY之間引入P2A自切割肽，構(gòu)建了MADS4-PR載體（圖1A）。結(jié)果表明，P2A的引入使得兩個基因有效表達，從而促進了顏色積累和蛋白富集（圖1BC）。這幫助研究人員精確識別分子實驗的最佳取樣時機，顯著提高采樣效率。研究團隊進一步選擇了參與花青素合成途徑正向調(diào)控因子PeMYB2作為靶基因。利用這一系統(tǒng)成功在蝴蝶蘭花瓣中實現(xiàn)了花青素和甜菜紅素的共存，創(chuàng)造出了自然界中不存在的花色組合。通過調(diào)整含有PeMYB2和RUBY的農(nóng)桿菌菌液注射比例，研究人員在花瓣上實現(xiàn)了兩種色素的梯度積累，呈現(xiàn)出漸變色彩效果。

圖1. 在蝴蝶蘭中建立有效的靶基因表達監(jiān)測系統(tǒng)并創(chuàng)造新型花色

蘭花的遺傳轉(zhuǎn)化受到多種因素限制。研究團隊利用類原球莖及愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，在蝴蝶蘭（Phalaenopsis）中通過RUBY指示獲得了陽性轉(zhuǎn)化事件。攜帶PeARF18（一個潛在的花形態(tài)調(diào)控因子）的RUBY載體成功生成了多個轉(zhuǎn)基因株系，并驗證了靶基因的插入和表達上調(diào)。此外，研究人員還在鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）中成功獲得了大量穩(wěn)定表達RUBY的轉(zhuǎn)基因再生芽和完整植株。由于蘭花生長期長、再生困難，研究團隊將進一步培育已篩選鑒定的紅色陽性植株，讓在自然環(huán)境條件下成長為多年生壯苗，以評估其各類性狀的長期表現(xiàn)。

圖2. 富含甜菜紅素的鐵皮石斛創(chuàng)制

研究人員借助這一系統(tǒng)，在同一組織中合成了自然界中不會同時共存的甜菜紅素和花青素。通過混合這兩種色素，使得研究人員能夠如同藝術(shù)家在調(diào)色板上調(diào)色一樣改變花色。因此，他們將這一系統(tǒng)命名為“Palette”（調(diào)色板），這也源自蝴蝶蘭（P. aphrodite）的縮寫（Pa）。

上海師范大學和深圳市蘭科植物保護研究中心聯(lián)培博士生楊振宇為該論文第一作者。上海師范大學明鳳教授和深圳市蘭科植物保護研究中心王志才副研究員為共同通訊作者。上海師范大學明鳳教授實驗室倪蘇、張棲語、付童、龐深深等，深圳蘭科中心孔德敏、王美娜，以及青州亞泰國際花卉公司張延亮、董春燕也參與了該研究。深圳市蘭科植物保護研究中心、青州亞泰國際花卉公司為該研究提供了材料與技術(shù)支持。該研究得到了國家自然科學基金、山東省重點研發(fā)計劃、深圳市科技創(chuàng)新委員會等項目的資助。

https://doi.org/10.1093/plphys/kiag281