PNAS | 華東師范大學李超團隊和北京大學雷曉光團隊在植物FERONIA受體激酶的小分子抑制劑開發領域取得新進展

FERONIA（FER）屬于長春花受體激酶家族CrRLK1L的核心成員之一，具有胞外區、跨膜區及細胞內激酶區的典型結構，這決定了其通過信號轉導調控植物發育的重要性。近二十年研究表明，FER受體激酶在植物生長發育、抗逆及抗病中發揮重要作用。而FER對農業生產以及作物性狀改良方面有待進一步深入研究。因此，開發高效的FER小分子工具，對于揭示其在精準農業中的調控機制具有重大意義。

2025年11月6日，北京大學化學與分子工程學院、北大-清華生命科學聯合中心雷曉光團隊與華東師范大學生命科學學院李超團隊在PNAS上在線發表題為Unveiling FERONIA Receptor Kinase-mediated Cellular Mechanisms with Small Molecule Inhibitor的研究論文。作者通過高通量篩選及根毛表型實驗，從4,378種化合物中鑒定出OTSSP167（命名Ferovicin，簡稱FRV）。通過結構生物學發現FRV結合于FER激酶結構域的ATP結合口袋。利用定量磷酸化蛋白質組學和FRV小分子工具，發現FRV抑制RALF1-FER-AHA2級聯反應，從而誘導細胞外環境堿化，調控細胞伸長。同時，RALF1通過促使FER的Ser695位點發生磷酸化，進而激活其功能。

本研究通過解析FER激酶區與FRV小分子的共晶結構發現，FRV結合于FER激酶的ATP口袋（圖1），與Lys565、Tyr610、Tyr612、Met613、Asp679等關鍵殘基通過氫鍵和π-π堆積作用穩定結合。FRV解離常數（0.4 μM）遠低于對照ATP (18.37 μM），表明FRV是一種高效的ATP競爭性抑制劑。ADP-Glo激酶活性檢測實驗顯示，FRV對FER的IC50值為70 nM，活性優于之前發現的其他抑制劑。進一步獲取了關鍵結合位點的點突變體包括K565A、Y610A、Y612A、M613A和D679A的，驗證了FRV和FER的分子結合機制。體外酶活實驗表明K565A、Y610A和D679A突變顯著削弱FRV抑制效果（IC50> 100 μM），且Y612A和M613A突變也會降低激酶基礎活性。表面等離子共振實驗顯示Y612A突變導致FRV結合親和力降低超1000倍，凸顯該殘基在抑制劑識別中的關鍵作用。以上結果共同證實FER的ATP結合口袋中五個關鍵殘基對FRV高效抑制FER激酶功能具有重要作用。

圖1. 共晶結構揭示FRV占據FER激酶ATP結合口袋

通過激酶活性（圖2A）和表面等離子體實驗（圖2B-F）評估FRV的選擇性，結果顯示其對FER激酶具有高度特異性，結合親和力顯著高于TMK4、BRI1等其它重要植物激酶，選擇性差異達數十倍。結構分析與分子對接表明，FRV與FER結合口袋中關鍵殘基（K565、Y610等）形成的疏水作用及氫鍵網絡是其選擇性的結構基礎，且結合構象更為穩定。此外，關鍵殘基在苔蘚和多種代表性被子植物中高度保守，揭示FRV具備廣譜抑制多物種中FER激酶的潛力。

圖2. 酶活與結合親和力分析揭示FRV對FER激酶的抑制機制

通過磷酸化蛋白質組學方法，發現RALF1小肽誘導了FER關鍵位點S695的磷酸化，而FRV處理抑制該位點的磷酸化（圖3A）。進一步通過組間的差異比較發現，FRV通過阻斷FER–RALF1的磷酸化，干擾了其下游信號通路。RALF1/CK和RALF1/(FRV+RALF1)之間有345個共同上調和364個共同下調的磷酸化蛋白（圖3B）。對這些共同蛋白進行GO分析，結果顯示主要富集于細胞生長、分裂、極性建成、細胞骨架組織等生物學過程（圖3C）。

圖3. 磷酸化組學發現FRV影響RALF1–FER信號通路

組學分析中發現在RALF1–FER介導的磷酸化蛋白中，質子泵AHA1/2的 S899位點磷酸化水平顯著上調（圖4B）。通過進一步檢測主根表皮分生區細胞的伸長情況，發現FRV能夠抑制RALF1–FER調控的細胞伸長過程（圖4A）。通過檢測細胞長度和胞外pH水平，發現AHA2S899D轉基因株系對RALF1呈現不敏感，而FRV可有效抑制RALF1效果（圖4C, D）。通過構建多種組合的單點突和多點突變體轉基因材料，發現FRV抑制FER的活性主要是通過影響其中兩個關鍵位點Y610和K565，而Y612、M613和D679的影響相對較�。▓D4E）。

圖4. RALF1–FER通過AHA1/2S899介導的胞外堿化作用調控細胞伸長

磷酸化蛋白組學還揭示了FRV抑制RALF1誘導的FER S695位點的磷酸化，而利用廣譜磷酸化抗體檢測，結果顯示FRV處理有效抑制了RALF1誘導的FER磷酸化（圖5A）。同時，采用制備的FER S695/T696磷酸化特異性抗體進行檢測，發現RALF1處理顯著促進野生型中FER的磷酸化水平升高（圖5B）。通過檢測細胞長度和胞外pH水平，發現FERS695A突變體對RALF1處理不敏感（圖5C, D）。以上結果表明通過FRV的處理和分析，有效地找出了S695是FER感受RALF1小肽而激活的關鍵位點，其對于調控細胞伸長具有重要作用。

圖5. RALF1通過激活FER-S695A磷酸化調控細胞伸長

綜上所述，本研究篩選出高效選擇性的FER激酶小分子抑制劑FRV，通過共晶結構解析等發現其特異性結合于FER激酶區的ATP口袋，從而抑制FER激酶活性。利用小分子工具FRV并結合磷酸化蛋白質組學技術，我們發現RALF1信號處理引起的關鍵磷酸化位點S695位點激活FER、引發下游AHA1/2質子泵S899位點的磷酸化，從而調控主根表皮分生區細胞生長。本研究闡明了FRV小分子化合物是FER有效的激酶抑制劑，該抑制劑對于解析FER受體激酶參與的生物學過程的研究和信號機制的解析具有重要輔助作用，并有望成為農作物遠緣雜交育種和免疫調控的重要工具。

華東師范大學生命科學學院李超教授和北京大學雷曉光教授為共同通訊作者，北京大學博士后孫萌澤和華東師范大學博士后逯佰艷為共同第一作者，上海師范大學戴紹軍教授和任巍巍博士參與了該項研究。該工作得到了國家自然科學基金杰出青年基金和重點項目、國家重點研發計劃、上海市科學技術委員會項目、The National Science Foundation of the US、北京分子科學國家研究中心、北大-清華生命科學聯合中心和博士后面上項目等的支持。

論文鏈接：

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2515322122