做 Annexin V/PI 雙染，最怕的不是「染不上」，而是圖看起來很像那么回事，結論卻站不住。

對照組凋亡率偏高、象限邊界怎么畫都別扭、同一批細胞重復性忽高忽低、審稿人追問「這到底是不是凋亡」…… 這些問題，很多時候并不是流式儀「不給力」，而是從樣本處理、對照設置到圈門邏輯，一開始就埋了坑。

今天我們就把流式檢測細胞凋亡中最常見、也最容易被忽視的幾個誤區捋一遍。建議收藏，上機前對照檢查一遍，能少走很多彎路。

先把原理捋順：Annexin V/PI 到底在看什么？

細胞凋亡早期，一個很典型的變化是細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine, PS）外翻到膜外側。

Annexin V 是一種鈣離子依賴的磷脂結合蛋白，可以和外翻的 PS 結合，因此常用于標記早期凋亡細胞。PI（碘化丙啶）則是一種膜不通透的核酸染料，正?；罴毎M不去；只有當細胞膜完整性受損時，PI 才能進入細胞并和核酸結合。

圖 1. Annexin V 結合外翻 PS 的原理示意。圖片來源：聯科生物

所以在經典 Annexin V/PI 四象限圖里，通?？梢赃@樣理解：

左下象限：Annexin V-/PI-，多為活細胞。

右下象限：Annexin V+/PI-，多為早期凋亡細胞。

右上象限：Annexin V+/PI+，多為晚期凋亡或繼發性壞死細胞。

左上象限：Annexin V-/PI+，常見于機械損傷、膜破裂或非典型死亡細胞。

圖 2. Annexin V/PI 四象限判讀示意。圖片來源：百度

但注意，這只是「常規判讀框架」，真正決定數據可信度的，往往是下面這些細節。

誤區一：Annexin V 陽性，就等于細胞凋亡

很多同學看到 Annexin V 陽性升高，就直接寫「細胞凋亡增加」。這個結論在常規藥物誘導模型中可能成立，但嚴格來說，Annexin V 陽性只能說明 PS 暴露增加，不能單獨證明細胞一定發生了典型凋亡。

PS 外翻并非凋亡獨有。細胞消化過度、劇烈吹打、離心條件過強、細胞膜受到機械損傷時，也可能出現 Annexin V 陽性。某些細胞活化狀態、其他形式的程序性細胞死亡過程，也可能伴隨 PS 暴露或膜完整性變化。

換句話說，Annexin V/PI 更適合回答「這批細胞的膜狀態和凋亡相關表型是否發生變化」，而不是單獨完成「死亡方式定性」。

更穩妥的做法是：如果你更關注「凋亡機制」，建議聯合檢測活化 Caspase-3、Caspase-3/7 活性、PARP 裂解、線粒體膜電位，或結合顯微形態學結果。尤其是要區分凋亡、焦亡、鐵死亡、壞死時，單靠 Annexin V/PI 很容易說不清。

圖 3. 活細胞 Caspase-3/7 活性與 Annexin V 雙重檢測示例。圖片來源：aladdin 官網

誤區二：樣本處理差一點，問題不大

很多「對照組凋亡率異常偏高」的問題，并不是處理因素真的誘導了凋亡，而是細胞在收樣、消化、離心、重懸過程中被人為傷到了。

常見雷區包括：

• 胰酶消化時間過長，貼壁細胞被過度刺激；

• 反復劇烈吹打，導致細胞膜受損；

• 離心力過高或離心次數過多，脆弱細胞被進一步損傷；

• 收樣時丟掉培養上清，只收貼壁細胞，導致已脫落的凋亡細胞被漏掉；

• 用普通 PBS 重懸 Annexin V 染色體系，忽略了 Annexin V 與 PS 結合需要 Ca2+。

比較穩妥的流程是：貼壁細胞輕柔消化，合并培養上清中的漂浮細胞；低速離心，比如 300 × g、5 min 左右；盡量減少洗滌次數；用配套的 1× Annexin V Binding Buffer 重懸；染色后避光，盡快上機。

圖 4. Annexin V/PI 四象限各區域含義示意。圖片來源：東極生物官網

這里尤其要提醒一點：Annexin V 染色體系不要隨手換緩沖液。EDTA 或缺鈣環境會影響 Annexin V 與 PS 的結合，可能帶來假陰性；染色后長時間放置，也可能讓細胞狀態繼續變化，導致結果偏移。

誤區三：一上來就看 Annexin V/PI 圖

四象限圖當然重要，但它不是第一步。在進入 Annexin V/PI 分析之前，建議先完成前置圈門。最基本的順序可以是：

第一步，看 FSC/SSC，排除明顯碎片和異常顆粒。

第二步，用 FSC-A/FSC-H 或 FSC-A/FSC-W 排除雙聯體和細胞團。

第三步，再在單細胞群里看 Annexin V/PI。

如果前置門沒做好，碎片、細胞團、死細胞殘片都可能混進后面的四象限里。結果看上去是「凋亡比例升高」，實際上可能只是樣本質量變差。

圖 5. FSC/SSC 前置圈門可幫助排除碎片和異常事件。圖片來源：Elabscience

對于狀態很差、碎片很多、細胞大小變化明顯的樣本，還可以增加 time gate，排除上機過程中堵針或流速不穩的時間段。這個小步驟在多樣本比較時很有用。

圖 6. 樣本狀態散點圖示例，異常群體會影響后續凋亡判讀。圖片來源：上海中喬新舟生物科技有限公司

誤區四：四象限直接機械切十字

Annexin V/PI 圖里，細胞群常常不是整齊地分成四塊，而是從活細胞區向 Annexin V 陽性區逐漸拖尾。凋亡本來就是連續動態過程，硬用一個固定十字把所有樣本切開，很容易把過渡群體算錯。

正確做法不是「每張圖都畫到最好看」，而是先用未染色對照、單染對照和陰性對照建立邊界，再在同批樣本中保持同一套門控。

如果樣本呈現明顯拖尾，可以考慮用多邊形門、等高線圖或密度圖輔助判斷。關鍵不是門畫得多復雜，而是標準要清楚、可重復、能解釋。

另外，補償一定要用單染對照來調。Annexin V-FITC 和 PI、PE、7-AAD 等通道之間都可能有光譜溢出。補償沒調好時，假陽性和象限漂移會非常明顯。

誤區五：只設空白對照就夠了

空白對照只能告訴你細胞自身散射和自發熒光的大概情況，遠遠不夠支撐 Annexin V/PI 的完整分析。

建議至少準備這些對照：

• 未染色對照：用于觀察自發熒光和初步調電壓；

• Annexin V 單染對照：用于補償和 Annexin V 陽性邊界設置；

• PI 單染對照：用于補償和 PI 陽性邊界設置；

• 陰性對照：健康或未處理細胞，用于判斷基礎死亡水平；

• 陽性凋亡對照：如星形孢菌素、紫杉醇、H2O2 等誘導模型，驗證體系能檢測到凋亡；

• 機械損傷對照：通過較強吹打或較高離心力模擬操作損傷，用于估計人為處理帶來的基線假陽性；

• 實驗組：正式分析不同處理條件下的凋亡變化。

圖 7. 未染、單染、雙染對照設置示例。圖片來源：聯科生物

如果要把數據寫進論文或項目報告，建議把「早期凋亡率」「晚期凋亡/死亡率」「總 Annexin V 陽性比例」 分開呈現，不要只給一個總百分比。這樣審稿人或讀者更容易判斷：變化到底發生在早期凋亡，還是細胞已經大量進入膜破裂階段。

最后還有兩個容易被忽略的小點

第一，凋亡是動態過程，單一時間點可能剛好錯過峰值。建議先做時間梯度，比如 6 h、12 h、24 h、48 h，再確定正式實驗的檢測窗口。

第二，不同細胞類型耐受性差異很大。懸浮細胞、原代細胞、神經元、肝細胞等往往更脆弱；腫瘤細胞株相對耐受，但也不能一概而論。換細胞系、換處理條件、換消化方式時，最好重新做預實驗。

上機前自查清單

發布實驗結果前，可以用下面這份清單快速檢查：

• 是否合并了培養上清中的漂浮細胞？

• 是否避免了過度消化、劇烈吹打和高離心力？

• 是否使用含 Ca2+ 的 Annexin V Binding Buffer？

• 是否在染色后盡快上機，并保持避光？

• 是否先做 FSC/SSC、單細胞門，再看 Annexin V/PI？

• 是否有未染、單染、陰性、陽性對照？

• 是否用單染對照完成補償？

• 是否把早期凋亡、晚期凋亡/死亡和總陽性比例分開報告？

Annexin V/PI 雙染是流式檢測細胞凋亡中最常用、也最容易上手的方法。但不要只盯四象限；把樣本、對照、圈門和聯合驗證做好，數據才經得起追問。