中國科學家成功創制新型超薄二維肽晶體

自1975年首次提出作為生物膜合成類似物的概念以來，高度有序的二維肽結構因其能夠通過原子級薄層架構模擬生物分子的對映選擇性識別而備受關注。然而，由于長程有序的層內氫鍵網絡難以建立和維持，構建超薄單晶二維肽材料始終面臨巨大挑戰。傳統的肽自組裝體系多局限于各向同性的納米球、一維納米纖維和納米管或三維超分子網絡和多孔框架。盡管這些非共價組裝結構展現出優異的生物相容性，但在藥物遞送、組織工程和生物傳感等領域的應用中，原子級分辨率的實現仍存在障礙。大多數二維肽組裝體缺乏單結晶度、化學穩定性和機械魯棒性，原因在于建立有序層內氫鍵網絡面臨挑戰。

近日，上海交通大學崔勇教授、董金橋副教授和上海科技大學曹克誠研究員、安徽工業大學袁國贊教授合作開發出一種金屬介導的β-折疊樣組裝策略，成功獲得了具有平行（圖1c）和反平行（圖1d）β-折疊組織結構的二維肽晶體，并可對序列、手性和側鏈化學進行可編程控制。研究表明，反平行排列促進了層內機械互鎖，從而增強了二維晶格的穩定性。通過對多種金屬-肽結構的晶體學分析，研究團隊揭示了關鍵的結構決定因素，并闡明了二維互鎖組裝的機制。這些層狀晶體可以剝離成獨立存在的、單晶超薄納米片，能夠立體選擇性地結合糖皮質激素和手性藥物分子，對映選擇性因子高達20.9。這一工作為創建結構多樣、表面可調、功能可編程的二維晶體材料建立了通用策略。相關論文以“Free-standing ultrathin two-dimensional peptide crystals”為題，發表在Nature Chemistry上。

圖1 | 金屬介導的β-折疊樣組裝用于構建單晶二維肽材料。 a，傳統肽組裝體典型形態的示意圖，包括納米球、納米纖維和水凝膠網絡。b，大多數二維肽組裝體缺乏單結晶度、化學穩定性和機械魯棒性，原因在于建立有序層內氫鍵網絡面臨挑戰。c,d，金屬介導的β-折疊樣組裝策略通過層內平行鏈排列(c)或層內反平行鏈排列(d)促進單晶二維肽組裝體的形成。

研究人員首先設計了能夠穩定β-折疊組裝同時抑制α-螺旋折疊的肽配體。選擇丙氨酸-丙氨酸二肽序列是因為其內在傾向于β-折疊構象，丙氨酸的小側鏈有利于擴展的線性排列。研究團隊對C末端進行羧基功能化，對N末端則用苯甲酸基團進行修飾。通過溶劑熱反應，這些配體與Zn(NO?)?在乙腈/水混合溶劑體系中反應，成功獲得了塊狀或針狀無色晶體。單晶X射線衍射分析揭示了這些結構的精妙之處。以Zn(Ba-LALA)-1為例，其結晶于手性空間群P2?，每個Zn2?采取四面體幾何構型，與三個肽配體和一個水分子配位。配體采用擴展構象，通過密集的氫鍵網絡形成平行β-折疊樣排列（圖2a）。通過對C末端丙氨酸進行替換（如苯丙氨酸、甘氨酸或β-丙氨酸），獲得了Zn(Ba-LALF)-2、Zn(Ba-LAG)-3和Zn(Ba-LAβLA)-4，這些結構在構型上與Zn(Ba-LALA)-1類似（圖2b-d）。將β-丙氨酸序列進行修飾得到的Zn(Ba-βLALA)-5也呈現類似架構（圖2e）。將肽鏈長度延伸至三肽得到了具有平行β-折疊樣組織的層狀晶體，包括Zn(Ba-GLALA)-6和Zn(Ba-βLALALA)-7（圖2f,g）。值得注意的是，這一組裝策略甚至能使高度靈活的四肽，如Zn(Ba-LAGLALA)-8和Zn(Ba-βGGLALA)-9，克服其內在折疊傾向，采用有序的二維結構（圖2h,i）。這些組裝體保留了與Zn(Ba-LALA)-1相同的配位模式，形成平行β-折疊樣層，厚度僅有微小變化（8-13 ?）。這些單晶結構共同凸顯了該組裝策略在不同側鏈、序列和肽長度上的廣泛適用性（圖2j）。

圖2 | 具有平行β-折疊樣排列的二維肽晶體。 a–i，Zn(Ba-LALA)-1 (a)、Zn(Ba-LALF)-2 (b)、Zn(Ba-LAG)-3 (c)、Zn(Ba-LAβLA)-4 (d)、Zn(Ba-βLALA)-5 (e)、Zn(Ba-GLALA)-6 (f)、Zn(Ba-βLALALA)-7 (g)、Zn(Ba-LAGLALA)-8 (h)和Zn(Ba-βGGLALA)-9 (i)的X射線晶體結構。所有結構均采用同構二維層狀架構，肽配體呈擴展、未折疊構象，組裝成由密集氫鍵網絡穩定的平行β-折疊樣排列。j，該組裝策略通過調控肽序列和主鏈長度，實現了對平行β-折疊樣堆積的控制。

有趣的是，當將N末端的苯甲酸替換為吡啶時，得到的二維肽晶體呈現出反平行β-折疊樣排列，并形成了機械互鎖結構。以Zn(Py-LALA)-10為例，其結晶于手性單斜空間群C2。每個Zn2?中心與四個Py-LALA配體配位，形成二維網格狀層。金屬導向組裝產生了一個具有菱形空腔（約10 ?）的二維晶格，呈螺旋P型基序排列。值得注意的是，在特定交叉點形成的反平行β-折疊樣氫鍵（約2.1 ?）誘導了層內機械互鎖，產生了高度有序且機械性能穩健的二維結構（圖3a）。詳細的晶體學分析表明，這種互鎖的二維網絡由于不對稱肽鏈的周期性纏結而呈現出P型拓撲手性。其對映體Zn(Py-DADA)-10則展現出鏡像的M型拓撲手性（圖3b），代表了與常規體系不同的一類手性二維材料。所得單分子層（約1.3 nm厚）通過重疊排列堆疊成層狀框架，由層間氫鍵穩定。此外，三肽配體Py-GLALA與Zn2?的組裝得到Zn(Py-GLALA)-11，這是一個類似的互鎖二維網絡（圖3c）。與Zn(Py-LALA)-10相比，Zn(Py-GLALA)-11在Zn-Zn距離和扭轉角上顯示出細微差異，同時保持了拓撲手性，其對映體Zn(Py-GDADA)-11也是如此（圖3d）。除了主鏈延伸，該策略還能實現側鏈調控。將N末端的L-Ala替換為L-Abu得到Zn(Py-LULA)-12（圖3e），而反向序列得到Zn(Py-LALU)-13（圖3f），兩者均保持可比較的二維拓撲結構。值得注意的是，互鎖框架能夠耐受極性側鏈：將N末端的L-Ala替換為L-Gln得到同構的Zn(Py-LQLA)-14（圖3g）。L-Gln采用折疊構象，形成層間氫鍵以緩解空間排斥并實現二維互鎖。該策略因此通過反平行β-折疊堆積在互鎖的二維肽結構中實現了對序列、側鏈極性和主鏈長度的控制（圖3h）。

圖3 | 二維肽晶體中的機械互鎖架構。 a–d，Zn(Py-LALA)-10 (a)、Zn(Py-DADA)-10 (b)、Zn(Py-GLALA)-11 (c)和Zn(Py-GDADA)-11 (d)的機械互鎖單分子層的X射線晶體結構和構象分析。e–g，Zn(Py-LULA)-12 (e)、Zn(Py-LALU)-13 (f)和Zn(Py-LQLA)-14 (g)的機械互鎖單分子層的單晶結構。h，該策略實現了在機械互鎖的二維肽結構中對肽序列、側鏈極性和主鏈長度的控制。

研究人員進一步探究了側鏈空間位阻、極性、氨基酸手性以及金屬配位幾何對二維互鎖組裝的影響。隨著空間位阻的增加，單晶X射線衍射分析揭示了一個從互鎖二維結構到不同拓撲結構的轉變，包括一維配位鏈Zn(Py-LALV)-15、二維非互鎖網絡Zn(Py-LFLA)-16以及三維框架Zn(Py-LALF)-17和Cd(Py-LMLA)-18（圖4a）。這些結果凸顯了序列變化和空間位阻在破壞吡啶配位、肽構象和氫鍵網絡中的關鍵影響。為考察側鏈極性對二維機械互鎖的影響，研究人員設計了帶有極性側鏈的配體。獲得了五個明確的結構并進行了分析（圖4a）：含L-His的配體形成一維配位鏈Cd(Py-LHLA)-19，其中咪唑側鏈未參與金屬配位；含L-Asp的配體產生三維框架Zn(Py-LDLA)-20，通過羧酸側鏈配位；含Cys的配體也產生三維框架Zn(Py-LCLA)-21，其中二硫鍵的形成對拓撲結構有所貢獻；含Thr和Ser的配體分別產生二維框架Zn(Py-LTLA)-22和二維非互鎖網絡Cd(Py-GLALS)-23，羥基側鏈參與氫鍵形成。這些結果表明極性殘基可以顯著改變配位模式并破壞機械互鎖的二維肽網絡的形成。接下來，研究人員考察了氨基酸手性在二維互鎖組裝中的作用。外消旋配體如Py-DLA和Py-LD與Zn2?配位形成二維肽網絡Zn(Py-GLA)-24和Zn(Py-LAG)-25，兩者均缺乏面內機械互鎖。異手性配體產生不同的結構：Zn(Py-DALA)-26形成三維多孔框架，而Zn(Py-GDALA)-27給出二維非互鎖網絡，兩者均與其同手性對應物觀察到的互鎖二維結構形成對比。研究人員進一步研究了金屬配位的影響。Py-LALA或Py-GLALA配體與Cd2?的組裝產生三維多孔框架Cd(Py-LALA)-28或二維非互鎖網絡Cd(Py-GLALA)-29，不同于與Zn2?形成的互鎖結構。這種差異源于它們不同的配位偏好：Zn2?通常采用四面體幾何，而Cd2?則傾向于八面體配位。這些發現揭示了氨基酸手性和金屬配位共同決定了層內互鎖的形成。為闡明層內互鎖的機制，研究人員分析了金屬配位幾何。在互鎖的二維結構中，吡啶基團在相鄰位置配位，而在非互鎖網絡中它們在相反位置配位。通過降低溫度或濃度，研究人員捕獲了互鎖前多晶型物PI-Zn(Py-LALA)-30和P-Zn(Py-LALA)-31（圖4b,c）。兩種結構均呈現一維配位鏈，其中Zn2?中心與兩個水分子配位，約一半的羧酸基團未配位。這些觀察結果，結合對照實驗，表明水分子在互鎖二維晶格的形成中起著關鍵模板作用。研究人員提出亞穩態Zn-肽鏈作為層內互鎖的前體，配位水分子逐漸被相鄰鏈的羧酸配體取代（圖4b）。這一機制得到了PI-Zn(Py-LALA)-30熱轉化為熱力學上有利的Zn(Py-LALA)-10的實驗支持。

圖4 | 機械互鎖二維肽網絡的形成機制。 a，改變側鏈空間位阻、極性和金屬離子對二維機械互鎖結構的影響。b，水分子介導的從一維鏈到二維互鎖結構的拓撲轉變示意圖。

鑒于這些層狀肽晶體的出色穩定性和機械性能，研究人員嘗試將其剝離成單晶超薄二維納米片（圖5a）。原子力顯微鏡納米壓痕測試顯示，Zn(Py-LALA)-10和Zn(Py-GLALA)-11的楊氏模量分別為25.3 GPa和32.4 GPa，超過了Zn(Ba-LALA)-1的19.7 GPa。場發射掃描電鏡揭示了明確的層狀形貌（圖5b-e）。液體超聲剝離在乙腈中最有效，得到的納米片厚度均勻（2-6 nm），橫向尺寸達1-5 μm，相當于約2-4層（圖5f,g）。原子力顯微鏡和動態光散射進一步證實了剝離納米片的微米級橫向尺寸和高縱橫比。掠入射廣角X射線散射顯示反射與它們的單晶結構一致。Zn(Py-LALA)-10納米片在12.3 ?和10.6 ?處顯示(001)和(-201)反射，而Zn(Py-LQLA)-14在11.2 ?和10.5 ?處顯示(001)和(200)面（圖5h,i）。高分辨透射電子顯微鏡進一步確認了這些納米片在原子尺度保留了結晶有序性。Zn(Py-LALA)-10的典型圖像顯示整個成像區域高度有序的二維肽晶格（圖5j,k）。在修正物鏡引起的襯度反轉后，觀察到4.0 nm?1的倒易晶格間距，對應于0.5 nm的實空間距離（圖5j插圖），這與滑移堆積模型一致。Zn(Py-LQLA)-14顯示出同樣有序的二維晶格（圖5l,m），倒易晶格間距為7.4 nm?1，支持相同的堆積基序。這些結果表明剝離的納米片保留了體相的面內結晶有序性，即使沿著c軸減少到僅幾個分子層也是如此。值得注意的是，Zn(Py-LALA)-10納米片在180天內保持膠體穩定性而無明顯形貌退化。這種層內互鎖架構相比于非互鎖的Zn(Ba-LALA)-1（60天內分解）和非共價組裝的肽-索烴納米片（7天內解組裝）提供了顯著增強的穩定性。這些結果共同確立了自上而下液體剝離作為制備獨立存在的單晶超薄二維肽納米片的通用且可規模化的途徑，相對于母體晶體的產率約為4-10 wt%。

圖5 | 超薄肽納米片的液體剝離與表征。 a，沿ab平面對Zn(Py-LALA)-10納米片進行自上而下剝離的示意圖。b–e，Zn(Py-LALA)-10和Zn(Py-LQLA)-14晶體的光學顯微鏡(b,c)和場發射掃描電鏡圖像(d,e)。b和d對應Zn(Py-LALA)-10，c和e對應Zn(Py-LQLA)-14。d中的藍色虛線框突出顯示了明確的層狀形貌。f–i，剝離的Zn(Py-LALA)-10和Zn(Py-LQLA)-14納米片的原子力顯微鏡圖像(f,g)和掠入射廣角X射線散射圖譜(h,i)。f和h對應Zn(Py-LALA)-10，g和i對應Zn(Py-LQLA)-14。原子力顯微鏡圖像(f,g)中的“4 L”表示四層厚度。j–m，Zn(Py-LALA)-10 (j,k)和Zn(Py-LQLA)-14 (l,m)納米片的高分辨透射電子顯微鏡圖像，插圖為快速傅里葉變換圖譜。k和m中的原始圖像區域分別對應j和l中藍色虛線框所標示的區域。k和m中分別顯示了相應的放大區域和模擬圖像。

圓二色譜揭示了Zn(Py-LALA)-10納米片中強烈的手性放大和增強的結構穩定性。這些特性，結合其機械魯棒性和極性表面，促使研究人員進一步探索其生物分子結合特性。研究聚焦于免疫調節糖皮質激素，因其在代謝、免疫調節和炎癥中的核心作用。熒光滴定實驗用于評估二維納米片與糖皮質激素的結合。所得結合常數范圍為7.0×102 M?1至3.9×10? M?1（圖6a,b）。紫外-可見滴定進一步證實了氫化可的松的氫鍵介導結合，Zn(Py-LALA)-10和Zn(Py-GLALA)-11的K?分別為2.5×10? M?1和2.1×10? M?1。重要的是，納米片的手性強烈影響結合親和力。例如，Zn(Py-DADA)-10與潑尼松結合的K?為3.9×10? M?1，遠高于其L-對映體的1.3×10? M?1。值得注意的是，Zn(Py-DADA)-10納米片對氫化可的松表現出顯著的對映體區分，對映選擇性因子達到7.4（圖6c）。對照實驗確認Zn(Py-LALA)-10納米片結合氫化可的松比體相晶體、游離配體或非互鎖類似物更強。值得注意的是，結合親和力遠超序列和側鏈匹配的Zn(Ba-LALA)-1（7.0×102 M?1），凸顯了層內互鎖在增加橫向表面積和增強手性結合位點可及性方面的作用。基于其對糖皮質激素的對映選擇性結合，研究人員將研究擴展到手性藥物化合物組。值得注意的是，帶有極性側鏈的Zn(Py-LQLA)-14相對于由非極性殘基組成的納米片表現出增強的結合親和力。其對L-多巴和L-α-甲基多巴的結合常數分別達到1.2×10? M?1和1.7×10? M?1（圖6d），超過了Zn(Py-LALA)-10和Zn(Py-GLALA)-11。此外，Zn(Py-LQLA)-14納米片對(R)-苯基丁酸表現出顯著的對映選擇性（對映選擇性因子為20.9，圖6e），而Zn(Py-GLALA)-11顯示出對左乙拉西坦的立體識別（對映選擇性因子為9.6）。這些發現強調了表面化學環境在調控二維肽納米片結合親和力和對映選擇性中的關鍵影響。為在分子水平上理解肽納米片的對映選擇性識別特性，研究人員以氫化可的松為代表客體進行了分子動力學模擬。模擬顯示氫化可的松通過氫鍵相互作用結合到Zn(Py-LALA)-10納米片表面（圖6f），形成穩定的主客體復合物，計算結合能為-74.7 kcal mol?1。該相互作用強于對Zn(Py-DADA)-10（-57.8 kcal mol?1）和Zn(Py-GLALA)-11（-68.3 kcal mol?1）的計算值（圖6g-i）。在此背景下，范德華相互作用也對對映選擇性結合做出了重要貢獻。這些結果與實驗觀察一致。為展示實際應用可行性，Zn(Py-LALA)-10納米片被整合到電紡聚偏氟乙烯膜中。在暴露于手性1-苯基乙胺飽和蒸氣時，Zn(Py-LALA)-10-NSs@PVDF膜表現出強烈的對映體區分能力，其中(S)-1-苯基乙胺顯示出比(R)-1-苯基乙胺顯著更強的相互作用（對映選擇性因子為12.0，定義為兩種對映體之間的猝滅比；圖6j）。手性吸附實驗進一步驗證了這種對映選擇性，從外消旋混合物中獲得76%對映體過量的(S)-1-苯基乙胺。對映體Zn(Py-DADA)-10-NSs@PVDF膜顯示出相反的選擇性（對映選擇性因子為11.6，圖6k），與其鏡像構型一致。對照實驗證實，空白PVDF膜或僅含Py-LALA配體和Zn2?的膜均未檢測到熒光或對映選擇性，證明對映選擇性傳感完全來自嵌入的肽納米片。

圖6 | 結合特性與對映體區分應用。 a，超薄肽納米片與G35滴定的結合常數。b，Zn(Py-LALA)-10和Zn(Py-GLALA)-11納米片對多種糖皮質激素的結合親和力。c，Zn(Py-LALA)-10和Zn(Py-GLALA)-11納米片對G32-G36的對映選擇性。d，Zn(Py-LQLA)-14納米片與藥物分子G41-G48滴定的結合常數。e，超薄肽納米片對手性藥物的對映選擇性。f–h，甲醇中Zn(Py-LALA)-10 (f)、Zn(Py-DADA)-10 (g)和Zn(Py-GLALA)-11 (h)與氫化可的松結合的分子動力學模擬建模與計算結合能。i，分子動力學模擬預測的各納米片對氫化可的松結合能的比較。j,k，Zn(Py-LALA)-10-NSs@PVDF膜(j)和Zn(Py-DADA)-10-NSs@PVDF膜(k)暴露于手性1-PEA時的熒光猝滅時間曲線。l，數據以三個獨立測量的均值±標準差表示。c和e中的EF值計算為對映體肽納米片之間結合常數的比值。

超薄二維肽結構在生物系統中無處不在，在多種生理過程中發揮著重要作用。本研究引入的金屬介導β-折疊樣組裝策略，用于構建一類獨特的超薄二維肽晶體。該方法能夠在二維方向上形成有序的β-折疊樣堆積，同時容納平行和反平行鏈取向。可逆的金屬-肽配位通過抑制肽折疊和穩定擴展構象來引導自適應組裝，使得通過側鏈、序列、手性、主鏈長度和金屬離子的系統調控來合成具有表面架構精確控制的層狀肽晶體成為可能。由反平行β-折疊樣肽堆積產生的層內互鎖顯著增強了機械穩定性，使得能夠分離出具有高結構完整性和放大的手性的獨立存在的單晶超薄納米片。這種可規模化策略允許從化學簡單的肽配體進行多克級合成，并通過自上而下的剝離支持結晶二維肽納米結構的大規模生產。所得的高縱橫比肽納米片表現出對糖皮質激素和手性藥物的對映選擇性結合，其性能隨序列和側鏈變化而變化，為功能優化提供了一個模塊化平臺。這些發現意味著超薄二維肽材料有潛力模擬在天然生物膜中觀察到的某些對映選擇性識別功能。與非互鎖類似物相比，層內機械互鎖增強了結構完整性，并定義了一個空間組織有序的結合環境，改善了結合親和力和對映選擇性。通過實現單晶生長，這種金屬介導的組裝克服了長期以來對合成二維肽系統進行原子分辨率結構分析的障礙。更廣泛地說，將金屬離子整合到明確定義的二維肽晶格中，為構建具有非常規結構和涌現功能的人工金屬蛋白建立了藍圖。從二維材料領域的更廣泛視角來看，這項工作為開發一類獨特的可編程二維晶體系統提供了一種通用方法，該系統具有可調特性和高結構精度。其內在手性可能使未來在自旋電子學、壓電學、鐵電學和磁電學等新興領域的探索成為可能。值得注意的是，這里報道的單晶二維肽組裝體有望表現出優異的生物相容性、生物安全性和生物可降解性，從而為克服傳統二維材料在生物和醫學應用中長期存在的局限性提供了一條有前景的途徑。