α, β-不飽和羰基化合物在制藥、農藥和材料等多個領域具有重要的作用. 在預先構建的分子框架中直接脫氫引入與羰基相鄰的C=C雙鍵是構建 α, β-不飽和羰基化合物的理想策略之一 [1] . 然而, 傳統化學方法常常面臨反應條件苛刻、步驟繁雜等問題, 且難以對去飽和化過程實現精準的立體化學控制 [ 2 , 3 ] . 此外, 盡管在自然界中存在一些天然的去飽和化酶 [4] , 但它們的底物普適性差, 難以作為催化劑被廣泛應用于有機合成( 圖1(a)).

圖 1 酶催化去飽和化的背景、實驗設計與實驗結果. (a) 去飽和化反應的研究背景; (b) 反應的設計思路與挑戰; (c) 酶催化位點選擇性去飽和化; (d) 反應條件篩選; (e) 去飽和化反應定向進化結果; (f) 代表性位點發散去飽和化結果; (g) 代表性位點選擇性脫氫動力學拆分結果; (h) 氘代實驗結果; (i) 去飽和化反應機理

黃素依賴的烯還原酶(ene-reductases, ERED)天然催化 α , β -不飽和羰基化合物中的雙鍵發生不對稱反式還原, 具有底物范圍好、熱穩定性高、易于表達等優點, 其催化的還原反應已經在工業上有所應用 [ 5 ~ 7 ] . 1995年, Massey課題組發現這類酶在氧化條件下, 可以發生天然還原過程的逆反應, 催化烯酮發生氧化芳構化反應 [8] . 2024年, 本課題組 [9] 與劉臻課題組 [10] 同時開發了基于嗜熱ERED的去飽和化體系在不對稱合成中的應用, 實現了環己酮化合物的去對稱化脫氫, 建立了一個通用的酶催化脫氫反應平臺( 圖1(b) ). 與此同時, 郭凱課題組也基于一類3-甾酮-Δ1-脫氫酶(3-ketosteroid dehydrogenase)— Tg DH(來自 Tepidamorphus gemmatus ), 實現了同一類型底物的立體選擇性去飽和化反應 [11] . 此后, 基于ERED的酶催化脫氫體系快速發展 [ 12 ~ 16 ] , 體現了該體系極大的應用潛力.

盡管各類催化脫氫體系已經有了長足的發展, 但仍無法實現對具有多個潛在脫氫位點的復雜底物進行后期“定制”脫氫. 傳統化學方法如2-碘酰基苯甲酸(IBX) [17] 、鈀催化 [18] 及鉑催化 [19] 對于 β 、 γ 位取代環狀酮實現位點選擇性去飽和反應依然極為困難. 此外, 催化劑控制的位點發散性去飽和化反應, 即通過單一酮類原料構建多樣化烯酮的方法迄今尚未成熟. 基于此, 我們團隊結合以往的實驗積累與經驗, 成功利用ERED對羰基 β 位的選擇性差異, 篩選出對不同反應位點具有選擇性差異的酶, 通過定向進化的手段, 實現了多種不同環狀酮化合物的位點發散性去飽和化, 多種復雜萜類、甾體分子的選擇性后期脫氫修飾以及位點發散性脫氫動力學拆分( 圖1(c) ). 該研究成果發表于 Nature Chemistry [20] .

在反應探索階段, 我們選擇了消旋的化合物3-苯基環己酮 1 和3-苯基環戊酮作為反應的模板底物, 考察室溫、空氣條件下, 不同烯還原酶對于這兩類化合物的脫氫反應效果( 圖1(d) ). 以化合物 1 為例, 在篩選了近30種不同烯還原酶后, 我們發現大部分的烯還原酶都傾向于在無取代基一側發生脫氫去飽和化得到產物 1a . 僅有來自 Galdieria sulphuraria 的嗜熱老黃酶(old yellow enzyme, OYE)GsOYE-WT呈現出相反的位點選擇性, 主要生成共軛產物 1b . 經過簡單的條件篩選, 我們確定以GkOYE-WT(來自 Geobacillus kaustophilus )和GsOYE-WT作為起點, 進一步嘗試通過定點飽和突變的方式來提高酶催化反應活性, 并提高(保持)反應的位點選擇性( 圖1(e) ). 在對酶活性中心附近重要氨基酸進行改造后, 我們最終獲得了優勢變體GkOYE-C26S-D73G-A60L-K109G和GsOYE-T25G-M234N, 它們可以高效催化3-苯基環己酮 1 發生脫氫反應, 分別以90%和70%的收率, >99:1的位點選擇性得到烯酮產物 1a 和 1b .

在此基礎之上, 我們進一步考察了反應的底物普適性. 圖1(f) 列舉了比較有代表性的一些位點發散性去飽和化結果. 對該反應體系, 一系列 β -取代芳基、雜芳基、烷基取代的環戊酮底物( 2 , 3 , 4 , 5 ), 環己酮底物( 6 , 7 ), 以及環庚酮底物( 8 )均可以普遍較好的收率, 優異的位點選擇性獲得相應產物. 此外, 遠端 γ 位含苯基取代的環庚酮底物, α , β -二取代茉莉酸甲酯底物同樣可以很好被該體系兼容. 對于一系列含多個反應位點的天然萜類、甾體類化合物( 11 , 12 , 13 , 14 ), 酶可以很好地在單一位點發生脫氫得到相應的烯酮產物. 特別值得關注的是, 當我們考察Hajos-Parrish酮衍生物 15 , 16 時, ERED催化的脫氫反應展現出與已有經典化學方法(IBX氧化、鈀催化氧化、二氯二氰基苯醌(DDQ)氧化)完全不同的位點選擇性. 在后續的研究中, 我們嘗試了一系列更具挑戰性的底物. 例如, 當消旋化合物 17 發生脫氫時, 會同時存在位點選擇性與立體選擇性的雙重問題( 圖1(g) ). 然而, 該催化平臺可以很好地控制雙重選擇性, 在四個反應位點中的一個發生脫氫, 實現位點發散性動力學拆分. 此外, 我們還考察了3,3-二取代環狀酮脫氫動力學拆分的底物范圍. 五元、六元和七元環狀酮均可以在該體系下兼容, 生成相應的 β -全季碳中心手性產物( 18a , 19a , 20a ).

通過氘代實驗以及理論計算的手段對反應的位點選擇性差異進行了考察. 氘代實驗結果顯示, 無論是 R 構型或是 S 構型底物, GkOYE都可以催化三個 β -位氫中的一個發生H/D交換(無取代基一側)( 圖1(h) , 右側). 而對于GsOYE, 四個 α -位的氫質子都發生了明顯的H/D交換, β -位H/D交換則是僅發生在有芳基取代基一側( 圖1(h) , 左側). 這一結果證實了酶催化去飽和化反應可以很好地區分羰基 β 位點間細微的位阻與電子差異. 根據以上結果, 我們給出了如下的反應機理( 圖1(i) ). 首先, 底物進入酶的活性位點, 酶活性中心的酪氨酸殘基(GkOYE為Y169, GsOYE為Y179)促進環狀酮羰基 α 位發生去質子化, 生成烯醇負離子中間體; 隨后, 底物的 β -氫負離子轉移至氧化態FMN的N5位置從而生成脫氫產物, 反應的位點選擇性取決于 β- 氫負轉移的位點( 圖1(i) ). 后續的理論計算, 包括分子對接(molecular docking)、分子動力學模擬(molecular dynamics, MD)、密度泛函計算(density functional theory, DFT)、能量分解分析(energy decomposition analysis, EDA)進一步證實了反應的高選擇性來自關鍵的酶-底物相互作用.

綜上所述, 我們利用烯還原酶天然還原的逆反應性, 構建了一種能同時控制位點選擇性與立體選擇性的羰基化合物去飽和化平臺. 該工作展現出酶催化脫氫反應溫和的反應條件、較寬泛的底物范圍、優異的選擇性控制, 特別是在復雜底物的后期選擇性脫氫中展示出酶催化與傳統化學催化的互補性. 獨特的選擇性控制來自酶對 β- 位氫微環境的高效識別. 這一工作的意義一方面為去飽和化反應提供了酶催化解決方法, 為傳統方法難以攻克的環狀酮位點選擇性脫氫提供了有效的解決手段, 為復雜分子后期“定制”化改造提供了全新的解決思路; 另一方面, 此類獨特的酶催化反應為深入理解酶反應機制, 推進生物合成與合成生物學研究提供了重要參考案例.

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