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新型Nby-Aby雙靶點融合蛋白有望提升IHC檢測靈敏度

HER2免疫組化（IHC）檢測是乳腺癌（BC）診斷的重要方法，在指導(dǎo)個體化治療策略中具有關(guān)鍵作用。然而，不同病理醫(yī)師在判讀IHC結(jié)果時存在不一致性，尤其對HER2低表達及陰性結(jié)果的判定差異顯著，可能導(dǎo)致臨床決策分歧，進而影響患者預(yù)后 [1]。由于HER2在細胞內(nèi)同時以二聚體和單體形式存在，診斷抗體在HER2二聚體上的部分結(jié)合位點可能在檢測過程中被遮蔽[2]。因此，準確檢測HER2二聚體對提升IHC診斷精確度至關(guān)重要。

近期，一項研究通過比對HER2異源二聚體結(jié)構(gòu)與帕妥珠單抗、曲妥珠單抗Fab段結(jié)合HER2的模式，發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合區(qū)域存在重疊[3]。為克服HER2二聚體造成的空間位阻，研究使用結(jié)合HER2不同表位的親和體（Aby）與納米抗體（Nby），構(gòu)建了融合蛋白（Nby-Aby）及人重鏈鐵蛋白（HFn）納米顆粒（Nby-HFn、Aby-HFn），并通過組織微陣列（TMAs）評估了Nby-Aby在乳腺癌組織中的檢測性能。本文整理關(guān)鍵信息，供讀者參考。

研究方法

HER2結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)比對分析

為驗證HER2二聚體可能產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)，從PDB數(shù)據(jù)庫獲取HER2胞外域（PDB: 1n8y）及其與EGFR（PDB: 8hgo）、HER3（PDB: 7mn5）、HER4（PDB: 8u4k）、帕妥珠單抗/曲妥珠單抗Fab（PBD: 6oge）、Nby（PDB:5my6）和Aby（PDB:3mzw）的晶體結(jié)構(gòu)。去除配體及水分子后，將所有結(jié)構(gòu)與HER2-ECD進行對齊，并通過多色可視化分析結(jié)合位點分布。

Nby-Aby融合基因及HFn納米顆粒質(zhì)粒構(gòu)建

通過優(yōu)化原核表達序列，設(shè)計合成Nby-Aby融合基因（中間通過G4S連接肽串聯(lián)，N端添加HA標簽）及Nby-HFn、Aby-HFn納米顆粒基因（N端通過G4S連接子與HFn融合，含HA標簽）。所有基因合成后被克隆至pET21a(+)載體（NdeI/XhoI酶切位點），構(gòu)建重組質(zhì)粒。

蛋白表達與鑒定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達后，經(jīng)Ni–NTA樹脂純化、透析及BCA定量。通過SDS-PAGE驗證蛋白純度，透射電鏡（HT-7800，100 kV，10萬倍）觀察納米顆粒形態(tài)。

IHC候選試劑篩選

采用三步法IHC篩選最佳檢測試劑。乳腺癌石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)及封閉后，分別與200μg/mL HFn、Nby-Aby、Nby-HFn、Aby-HFn孵育過夜，以PBS為陰性對照，6μg/mL傳統(tǒng)抗HER2抗體為陽性對照。HA標簽一抗（1:200）及HRP標記二抗依次孵育，DAB顯色后蘇木素復(fù)染。

統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0比較Nby-Aby重評結(jié)果與初始診斷數(shù)據(jù)，分析其與ISH、Ki67、腫瘤大小的相關(guān)性。Fisher精確檢驗界定統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。

結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過AlphaFold預(yù)測Nby-Aby、Nby-HFn和Aby-HFn結(jié)構(gòu)，與HFn晶體結(jié)構(gòu)（PDB:5n27）比對分析，使用PyMOL與Nby-Aby一起進行多體可視化。

研究結(jié)果

Nby與Aby在HER2胞外域的結(jié)合區(qū)域不同于HER家族蛋白及帕妥珠/曲妥珠單抗Fab

通過比對PDB數(shù)據(jù)庫中所有相關(guān)晶體結(jié)構(gòu)，并將Nby和Aby與EGFR（圖1A）、HER3（圖1B）、HER4（圖1C）、帕妥珠單抗和曲妥珠單抗Fab（圖1D）的結(jié)合區(qū)域進行對齊，研究發(fā)現(xiàn)Nby和Aby與HER2胞外域的結(jié)合區(qū)域在空間上與上述蛋白均不重疊。Nby和Aby主要結(jié)合HER2胞外域的Ⅰ和Ⅲ結(jié)構(gòu)域，這與HER家族蛋白的二聚化區(qū)域（Ⅱ結(jié)構(gòu)域）及部分Fab片段在HER2上的結(jié)合位點（Ⅱ結(jié)構(gòu)域）明顯不同。

圖1 不同蛋白在HER2胞外域的結(jié)合區(qū)域

Nby-Aby及HFn納米顆粒的表達與鑒定

質(zhì)粒構(gòu)建并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)后，經(jīng)1 mM IPTG誘導(dǎo)并通過SDS-PAGE鑒定，可見菌液在23 kDa（Nby-Aby）、25 kDa（HFn）、34 kDa（Aby-HFn）和40 kDa（Nby-HFn）處出現(xiàn)特異性條帶（圖2A），而未誘導(dǎo)組無相應(yīng)條帶。純化后的蛋白也在對應(yīng)分子量處呈現(xiàn)單一條帶（圖2A）。透射電鏡結(jié)果顯示，HFn、Aby-HFn和Nby-HFn均成功形成納米顆粒（圖2B）。

圖2 Nby-Aby融合蛋白和HFn納米顆粒的制備和表征

Nby-Aby在HER2 IHC檢測中表現(xiàn)出優(yōu)于傳統(tǒng)抗體及HFn納米顆粒的靈敏度

研究采用Nby-Aby、Aby-HFn、Nby-HFn、HFn和PBS進行IHC檢測，并與傳統(tǒng)方法進行了對比。結(jié)果顯示，在案例1中（圖3A），傳統(tǒng)方法判定HER2評分為0，而Nby-Aby重新評估為2+，并識別出傳統(tǒng)方法未檢測到的癌細胞；案例2中（圖3B），傳統(tǒng)評分1+被Nby-Aby重新評定為2+；案例3中（圖3C），傳統(tǒng)評分2+被提升至3+；案例4中（圖3D），所有檢測蛋白與傳統(tǒng)方法結(jié)果一致（2+或3+）。這些結(jié)果驗證了研究假設(shè)：利用Nby-Aby結(jié)合不同區(qū)域以克服HER2 IHC中的空間位阻，能夠提高HER2的評分。

圖3 使用多種蛋白質(zhì)探針和常規(guī)抗體對HER2表達進行IHC分析比較

Nby-Aby較傳統(tǒng)抗體提高了HER2 IHC檢測陽性率

為進一步減少其他抗體的潛在干擾并評估靈敏度提升，將Nby-Aby與HRP偶聯(lián)后進行IHC檢測。在TMAs-1樣本（初始診斷為0和1+）中，Nby-Aby準確識別出組織中的癌細胞，并將HER2評分從0（圖4A）或1+（圖4B）提升至2+和3+；在初始診斷為2+的TMAs-2樣本中，Nby-Aby進一步確認診斷或提升至3+（圖4C）；初始3+樣本仍維持3+（圖4D）。Nby-Aby提升HER2評分及陽性率的潛在原因如圖4E所示。

圖4 使用Nby-Aby重新評估HER2 IHC評分并提出分數(shù)提升的可能機制

匯總Nby-Aby與初始診斷的HER2評分數(shù)據(jù)并結(jié)合補充信息（ISH、Ki67%和腫瘤大小）進行統(tǒng)計分析顯示。將HER2評分與ISH結(jié)合時，初始診斷組的IHC陽性及低表達（1+、2+、3+）率為64%，而Nby-Aby診斷組為89%，差異十分顯著（P<0.001）；結(jié)合Ki67或腫瘤大小時，在Ki67>30%且腫瘤尺寸≤2cm的組中，Nby-Aby與傳統(tǒng)方法相比也存在顯著差異（P<0.05）。這表明Nby-Aby可能更準確識別具有潛在侵襲性特征的腫瘤，其用于HER2IHC檢測可較傳統(tǒng)方法顯著提高靈敏度。詳細信息見表1。

表1 Nby-Aby診斷與初始診斷聯(lián)合其他腫瘤指標評估的HER2表達水平比較

Nby-HFn、Aby-HFn及Nby-Aby的結(jié)構(gòu)預(yù)測

為探究納米顆粒效果不符預(yù)期的原因，研究者通過AlphaFold預(yù)測了Nby-HFn、Aby-HFn和Nby-Aby的晶體結(jié)構(gòu)。分析顯示，盡管Nby-HFn和Aby-HFn均能按設(shè)計自組裝為納米顆粒，但其HA標簽暴露不充分（圖5A、B），限制了與HA抗體的有效結(jié)合；盡管每個顆粒含24個HA標簽，但在三步法檢測中可及性較低。相比之下，Nby-Aby分子尺寸顯著小于納米顆粒（圖5C），且HA標簽未遮蔽。這解釋了HER2結(jié)合納米顆粒在三步法中效果不佳的原因，盡管其設(shè)計在理論上應(yīng)提高靈敏度。

圖5 Nby-HFn、Aby-HFn和Nby-Aby的預(yù)測結(jié)構(gòu)

文章小結(jié)

研究表明，Nby-Aby融合蛋白通過雙靶向和結(jié)合不同區(qū)域，顯著增強了IHC中HER2的檢測靈敏度，而不影響其二聚化。與傳統(tǒng)的IHC方法相比，Nby-Aby提高了HER2 IHC評分并提高了靈敏度。這些發(fā)現(xiàn)表明，通過雙靶向和結(jié)合HER2-ECD的不同區(qū)域可以減少空間位阻，提高IHC的診斷敏感性。研究仍存在局限性，如樣本量有限且缺乏長期隨訪數(shù)據(jù)以確定使用Nby-Aby檢測的HER2評分較傳統(tǒng)方法增加的臨床意義等。但總體而言，研究提示未來HER2 IHC檢測中可能需要更多地關(guān)注試劑與HER2二聚化區(qū)域分開的雙靶向或靶向區(qū)域，以進一步提高診斷準確性。

參考文獻：

[1]Sajjadi E, et al. Improving HER2 testing reproducibility in HER2-low breast cancer. Cancer Drug Resist. 2022 Sep 1;5(4):882-888.

[2]Schrohl AS, et al. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies. Histopathology. 2011 Nov;59(5):975-83.

[3]Luo L, et al. Dual-targeting and steric hindrance resolution in HER2 IHC: a novel approach to improve diagnostic sensitivity. BMC Cancer. 2025;25(1):1231. Published 2025 Jul 29.

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