本文系Food Science and Human Wellness原創編譯，歡迎分享，轉載請授權。

一

Introduction

桃金娘科芳香植物崗松分布于澳大利亞至東南亞，除了用作觀賞，還是食品和香料工業的重要原料。現代研究表明，崗松中含有揮發油、間苯三酚類、色原酮類和黃酮類化合物，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤等生物活性；在民間常用于治療炎癥相關疾病，如高熱、黃疸型肝炎、腸胃炎、膀胱炎和類風濕關節炎（RA）等。

RA是一種累及多關節滑膜炎病變為特征的全身性、自身免疫性疾病，其病程漫長、遷延反復、難以根治，在臨床上常以西藥維持治療，但長期用藥往往引起嚴重不良反應。天然植物或化合物在干預RA中獨具優勢，具有多靶點和多途徑整合作用的特點，且毒性小成本低。據報道，崗松中化合物baeckein E在25~100 mg/kg的劑量范圍內能顯著抑制CIA小鼠的足趾腫脹，并緩解關節軟骨基質的降解和炎癥細胞浸潤。

在中國南方常采集崗松葉制成“崗松茶”飲用，急性經口毒性實驗表明，其甲醇、乙醇和水提取物均沒有觀察到死亡和不良反應，提示其作為人類食用的安全性。鄭州大學藥學院賈貝西副教授課題組，依托現有的抗RA天然藥物研發平臺，將網絡藥理學分析、分子對接與體內外實驗驗證相結合，探討崗松抗RA活性成分及作用機制，為“崗松茶”在功能食品領域其保健價值開發提供科學依據。

二

Results and discussion

Part I基于CIA大鼠模型的崗松（BFL）抗RA藥效學評價

采用牛Ⅱ型膠原和不完全弗氏佐劑混合乳化劑構建CIA大鼠模型，連續灌胃給藥20天后，與模型組相比，各給藥組對CIA大鼠的足趾腫脹度（圖1B）、AI指數（圖1E）、滑膜組織增生（圖1F）、骨侵蝕（圖1G）等病理情況有不同程度的改善作用；與陽性藥TPT組相比，崗松（BF）治療組的脾、胸腺指數顯著降低（圖1D），說明BFL對CIA大鼠免疫器官具有一定的保護作用；此外，BFL能顯著降低CIA大鼠血清中TNF-α、IL-6水平，同時增加IL-10含量（圖1H-J），表明BFL對CIA大鼠具有良好的治療作用。

圖1 BFL對CIA大鼠的治療作用。（A）體重變化；（B）足趾腫脹度變化；（C）足趾腫脹形態特征；（D）AI評分；（E）胸腺和脾臟指數；（F）組織病理學（H&E，箭頭指示滑膜增生）；（G）關節影像學（X射線）；血清炎癥因子水平：（H）TNF-α、（I）IL-6和（J）IL-10（J）。與空白組相比，*P < 0.05，**P < 0.01；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01。

Part II BFL中抗炎活性成分篩選

BFL提取物經HPLC色譜分析可知，其中化合物楊梅素-3-O-α-L-鼠李糖苷（峰1）和5-羥基-7-甲氧基-2-異丙基色原酮（Chro，峰2）含量最為豐富，分別為8.4%和9.1%（圖2）；采用LPS誘導的RAW264.7細胞模型，測定2 種化合物的抗炎活性，IC50值表明化合物Chro在減少NO、IL-6和TNF-α的分泌方面優于陽性藥物地塞米松（表2），具有潛在的抗炎特性；因此，本文以化合物Chro為突破口來探索BFL抗RA的作用機制。

圖2 BFL提取物HPLC分析及主要活性成分含量

表2 BFL中主要成分的抗炎活性

Part III Chro抗RA的網絡藥理學分析

通過SwissTargetPrediction、SEA、和TargetNet數據庫，檢索化合物Chro靶點136 個，從NCBI-Gene、GeneCards和DisGeNET數據庫獲得RA疾病相關基因1 489 個，二者取交集得到54 個共同靶點（圖3A），作為化合物Chro抗RA的相關靶標。將這54 個共同靶點進行PPI網絡分析可知，PTGS2、ESR1、CREB1、RELA（P65）、IL-2、PPARG、APP和AHR為化合物Chro抗RA的關鍵靶標（圖3B）。對54 個交集靶點進行GO和KEGG富集分析，確定50 個GO條目，其中生物過程（BP）20 個，分子功能（MF）25 個和細胞組分（CC）5 個，將每個類別排名前20 條目繪成直方圖（圖3C）；KEGG分析出30 條相關通路（P-value < 0.1, FDR < 0.4），在排名前20的通路中，PI3K-Akt、Ras、破骨細胞分化、NF-κB、TNF等信號通路與RA疾病密切相關（圖3D）。將54 個交集靶點與排名前20通路導入Cytoscape構建“化合物-關鍵靶點-作用通路”網絡，進一步分析表明Chro主要通過PI3K-Akt信號通路調控關鍵靶標MAPK10、RELA、RAC1、CREB1和NOS2，在干預RA中發揮重要作用（圖3E）；由于網絡藥理學預測的作用機制存在一定局限性，后續將優先考慮Count計數和Degree值最大的PI3K-Akt通路及其節點蛋白PI3K、PDK1、Akt和RELA作進一步的實驗驗證。

圖3 化合物Chro抗RA的網絡藥理分析。（A）Chro和RA靶點的維恩圖；（B）Chro抗RA的PPI網絡圖；（C）GO功能富集分析（Top 20）；（D）KEGG通路富集分析（Top 20）；（E）“化合物Chro-關鍵靶標-作通通路”網絡圖。

PartIV化合物Chro與關鍵通路蛋白的分子對接

分子對接用于評價化合物Chro與關鍵通路蛋白PI3K、PDK1、AKT和RELA之間的相互作用（圖4），所有結合能均低于-5.0 kcal/mol，表明化合物Chro與這4 種蛋白具有良好的結合親和力，可以自發結合形成復合物，Chro分子主要通過4-羰基、5-羥基和2-異丙基與相應的氨基酸殘基形成氫鍵和疏水相互作用。

圖4 化合物Chro與關鍵蛋白（A）PI3K、（B）PDK1、（C）AKT和（D）RELA的結合位點及相互作用模式

PartV化合物Chro對RA滑膜成纖維細胞（RA-FLS）的作用及機制Chro對RA-FLS細胞活力、遷移和侵襲能力的影響

RA-FLS在RA的發病機制中起著關鍵作用，本文以此作為細胞模型開展實驗。Chro的化學結構如圖5A所示，藥物作用24 h后，CCK-8檢測結果顯示，RA-FLS細胞的存活率以劑量依賴的方式受到抑制（圖5B），0~50 μg/mL為Chro的無毒濃度、0~0.45 μg/mL為陽性藥MTX的低毒濃度（細胞存活率 ≥ 60%），并以此設置后續實驗濃度。RA-FLS可以遷移并侵入關節軟骨和骨，導致軟骨和骨的破壞以及關節損傷，通過Transwell實驗檢測細胞遷移侵襲能力，結果顯示，與對照組相比，Chro能顯著抑制RA-FLS細胞的遷移和侵襲能力（P < 0.001，圖5C-F）。

圖5 Chro化學結構（A）。化合物Chro對RA-FLS（B）細胞活力、（C）遷移及（D）侵襲能力的影響。與對照組相比，***P < 0.001，****P < 0.000 1。

Chro誘導RA-FLS細胞凋亡和對細胞周期的阻滯作用

促進RA-FLS凋亡是RA的治療策略，如圖6A-B所示，化合物Chro可顯著誘導細胞凋亡，抑制RA-FLS的過度增殖，并將其阻滯在G2/M期（4N）（P < 0.001）；此外，Western blot檢測結果顯示，Chro顯著下調RA-FLS細胞中凋亡相關蛋白Cyclin B1、CDK1、CDK2、Mcl-1和Bcl-2的表達，而使G2/M期特征蛋白cleaved-Caspase 3表達增加（圖6C）。

圖6 化合物Chro對RA-FLS細胞（A）凋亡、（B）周期及（C）相關標志蛋白表達的影響。與對照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；ns，無顯著性（P > 0.05）。

Chro抑制RA-FLS細胞中IL-6、IL-8、IL-1β、MMP-1、MMP-3和MMP-9的分泌

RA-FLS產生各種細胞因子和基質金屬蛋白酶（MMPs），以促進炎癥和關節破壞。以TNF-α（400 ng/mL）誘導RA-FLS細胞造模，ELISA試驗表明，化合物Chro以濃度依賴的方式降低了細胞上清液中IL-1β、IL-6、IL-8和MMP-3的水平（P < 0.05，圖7A）；RT-qPCR結果顯示，與模型組相比，Chro組IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-3和MMP-9的mRNA表達顯著降低（P < 0.001，圖7B）。

圖7 化合物Chro對RA-FLS細胞炎癥因子及MMPs（A）分泌及（B）mRNA表達的影響。與對照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；ns，無顯著性（P > 0.05）。

Chro抑制RA-FLS細胞中PI3K-Akt信號通路

在網絡藥理學分析和分子對接基礎上，對化合物Chro通過PI3K-Akt通路抗RA的潛在機制，做進一步的體外實驗驗證。Western blot檢測顯示，Chro顯著下調PI3K、PDK1、p-Akt/Akt和p-NF-κBp65/NF-κBb65的表達（P < 0.001，圖8A）；進而設計PI3K激活劑（740Y-P）實驗，當Chro與740Y-P聯用時，740Y-P對PI3K-Akt通路的激活作用被Chro部分逆轉（P < 0.01，圖8B），提示化合物Chro通過抑制PI3K-Akt通路對RA-FLS細胞發揮干預作用。

圖8 化合物Chro對RA-FLS細胞中（A）PI3K-AKT通路的影響及對（B）740Y-P激活PI3K的抑制作用。與對照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；與模型組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001；ns，無顯著性（P > 0.05）。

三

Conclusion

本文通過整合網絡藥理學、分子對接與實驗驗證，對崗松葉（BFL）抗類風濕性關節炎（RA）進行系統性深入研究。首先進行體內藥效評價，結果表明BFL提取物可以通過抑制關節腫脹、降低免疫器官指數、改善踝關節病理以及調節CIA大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10水平來有效改善RA；進而以BFL中高含量活性成分5-羥基-7-甲氧基-2-異丙基色酮（Chro）為突破口，經網絡藥理學預測和分子對接計算，提示PI3K-Akt信號通路是化合物Chro抗RA的一個關鍵因素；進一步體外細胞驗證表明，化合物Chro可抑制RA-FLS細胞遷移、侵襲，誘導細胞凋亡、使其停滯于G2/M期，并通過抑制PI3K-Akt通路減少炎性細胞因子的分泌。由此可知，BFL中化合物Chro是其改善RA癥狀的主要活性成分，相關實驗數據為功能食品“崗松茶”的開發提供理論依據。

作者簡介
第一作者

郭雪揚，女，鄭州大學藥學碩士研究生，主要研究方向為中藥活性成分及作用機制，參與國家自然基金1 項，河南省自然基金1 項，《河南省中藥材標準》（2023年版）及《河南省中藥飲片炮制規范》（2022年版）的修訂。

通信作者

賈貝西，女，鄭州大學藥學院副教授，碩士研究生導師，主要從事中藥活性成分及質量評價工作，致力于民族特色壯瑤藥研發，主持完成國家自然科學基金2 項，中國博士后科學基金3 項，河南省自然科學基金1 項，以第一及通信作者在Food Chemistry，Food Science and Human Wellness，Journal of Functional Foods，Fitoterapia、中華中醫藥學刊等發表專業研究論文10余篇。

Combining network pharmacology, molecular docking, and experimental verification to investigate the anti-rheumatoid arthritis effect and mechanism of Baeckea frutescens leaves

Xueyang Guoa, Mengyao Zhanga, Haixia Caib, Xinyue Jianga, Siyuan Zhoua, Wen Gonga, Zijiao Weia, Weili Qiaoa, Beixi Jiaa,*

a Department of Pharmacognosy, School of Pharmaceutical Science, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China

b Department of Pharmacy, Henan Provincial People’s Hospital, Zhengzhou 450003, China

*Corresponding author.

Abstract

The aromatic Baeckea frutescens leaves (BFL) known as “Gang-Song-Cha” is a popular drink (Tea) in South China. To explore the healthcare value, a systematic and in-depth study on BFL alleviating rheumatoid arthritis (RA) was carried out by integrating network pharmacology, molecular docking, and experimental verification. The efficacy was first evaluated, and the BFL extract could ameliorate RA by inhibiting articular swelling, lowering immune organ index, improving the ankle pathologies, and regulating serum levels of tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin (IL)-6, and IL-10 in CIA rats. Then the anti-RA mechanism of BFL was investigated by leveraging the high-content and active component 5-hydroxy-7-methoxy-2-isopropylchromone (Chro), and the potential signaling pathway and related target proteins for Chro acting on RA were analyzed by Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment and docking simulation. Finally, the experimental validations were conducted on rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (RA-FLS), and compound Chro could inhibit cell invasion and migration, block cell cycle at G2/M phase and induce apoptosis, and reduce the secretion of inflammatory cytokines by suppressing the PI3K-Akt pathway. These results provided pharmacological basis for the folk usage of “Gang-Song-Cha” for intervening RA.

Reference:

GUO X Y, ZHANG M Y, CAI H X, et al., Combining network pharmacology, molecular docking, and experimental verification to investigate the anti-rheumatoid arthritis effect and mechanism of Baeckea frutescens leaves[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(7): 9250166. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250166.

文章編譯由作者提供

編輯：王佳紅；責任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創意

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