引言

抗體偶聯(lián)藥物（ADC）使用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)連接子將抗體的特異性和長循環(huán)時間與化學(xué)細(xì)胞生長抑制劑或其他活性藥物的毒性結(jié)合起來，以降低全身毒性并提高治療指數(shù)。這種大分子和小分子的結(jié)合增加了復(fù)雜性。需要多種生產(chǎn)過程來生產(chǎn)天然抗體、藥物和接頭，然后將上述實體偶聯(lián)形成最終的抗體-藥物偶聯(lián)物。

連接的過程進一步增加了控制點的數(shù)量，導(dǎo)致需要額外的規(guī)范和強化的分析表征。通過將對生產(chǎn)過程的科學(xué)理解與基于風(fēng)險的方法相結(jié)合，可以在需要控制的地方證明質(zhì)量，并避免冗余的可比性研究、規(guī)范或產(chǎn)品特征。在產(chǎn)品開發(fā)生命周期中，這將使過程認(rèn)證能夠?qū)Ｗ⒂趯|(zhì)量至關(guān)重要的領(lǐng)域，并防止重復(fù)研究。ADC的模塊3通用技術(shù)文檔的結(jié)構(gòu)需要反映每個生產(chǎn)過程和整體質(zhì)量方法。從歷史上看，監(jiān)管機構(gòu)對其結(jié)構(gòu)提出了不同的期望。本文概述了要包含的基本信息，并表明只要包含足夠的交叉引用，多種方法都是有效的。

一、ADC的復(fù)雜性結(jié)構(gòu)與生產(chǎn)控制策略

抗體在ADC療效中起著關(guān)鍵作用，通過靶點介導(dǎo)的攝取提供腫瘤特異性，延長細(xì)胞毒素的循環(huán)半衰期，并提供額外的機制，如受體中和、下游信號通路抑制和免疫效應(yīng)功能激活。ADC的結(jié)構(gòu)由抗體、連接子和細(xì)胞毒性藥物三個主要部分組成，通過化學(xué)連接將藥物精準(zhǔn)遞送至癌細(xì)胞。

這種混合模式的復(fù)雜性意味著其生產(chǎn)過程更為復(fù)雜，需要多個生產(chǎn)過程來生產(chǎn)天然抗體、藥物和連接子，隨后進行偶聯(lián)形成最終的ADC。

1. 控制策略的演變

ADC的控制策略必須保證為患者提供一致安全有效的藥物。早期的ADC工藝通常使用隨機性的非定點偶聯(lián)技術(shù)，可能導(dǎo)致藥物-連接子在抗體上的位置和數(shù)量的變異。然而，多年的經(jīng)驗表明，即使是非定點偶聯(lián)（如天然賴氨酸偶聯(lián)），由于只有部分賴氨酸被修飾，也能生產(chǎn)出非常一致的產(chǎn)品，因此控制策略可以依賴于對平均藥物抗體比率（DAR）的控制。相比之下，現(xiàn)代定點偶聯(lián)技術(shù)（如通過半胱氨酸突變、非天然氨基酸、醛基標(biāo)簽或酶介導(dǎo)等）在藥物-連接子的數(shù)量和位置上能產(chǎn)生高度一致的ADC，減少了偶聯(lián)異質(zhì)性風(fēng)險。下圖展示了不同偶聯(lián)化學(xué)策略（如天然賴氨酸、天然半胱氨酸和定點修飾）對應(yīng)的DAR分布差異，其中定點修飾策略能實現(xiàn)最均一的DAR分布。

2. 控制點與風(fēng)險導(dǎo)向策略

對于藥物中間體（DI），其控制策略應(yīng)反映支持藥物物質(zhì)（DS）和藥物產(chǎn)品（DP）質(zhì)量所需的屬性控制，而非傳統(tǒng)上對原料藥或制劑的控制水平。通過對生產(chǎn)過程的科學(xué)理解結(jié)合風(fēng)險導(dǎo)向策略，可以在需要控制的點展示質(zhì)量，從而避免冗余的可比性研究、規(guī)格或產(chǎn)品表征。下圖展示了ADC生產(chǎn)與控制策略的示例流程，包括藥物-連接子合成、mAb生產(chǎn)、偶聯(lián)、DS放行和DP生產(chǎn)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)及其控制點。

下面的列表詳細(xì)列出了從mAb中間體、藥物-連接子中間體到DS和DP各階段的質(zhì)量控制點和放行要求，區(qū)分了臨床階段和商業(yè)化階段的不同控制策略。

二、關(guān)鍵質(zhì)量屬性的考量與規(guī)格設(shè)定

1. 單克隆抗體中間體的質(zhì)量屬性

用于ADC生產(chǎn)的mAb中間體，其主要質(zhì)量屬性在于對目標(biāo)分子的特異性結(jié)合。其他屬性主要關(guān)注有害雜質(zhì)和污染物的缺乏。由于mAb中間體的預(yù)期用途是偶聯(lián)成ADC，其控制策略應(yīng)不同于作為藥物物質(zhì)的mAb。例如，對于病毒因子、糖基化、宿主細(xì)胞蛋白和殘留DNA等屬性，控制應(yīng)在mAb中間體階段進行，因為后續(xù)ADC DS或DP生產(chǎn)過程并不引入或緩解這些雜質(zhì)。而對于氧化水平、脫酰胺或天冬氨酸異構(gòu)化等可能在ADC生產(chǎn)過程中受影響的屬性，則需在mAb中間體階段設(shè)定更嚴(yán)格的限制。

2. 藥物-連接子中間體的質(zhì)量屬性

藥物-連接子中間體作為小分子，其主要質(zhì)量屬性在于連接子與抗體特定殘基反應(yīng)形成共價鍵的能力以及藥物的毒性。對于可偶聯(lián)雜質(zhì)，通常在藥物-連接子中間體階段進行控制，因為偶聯(lián)后這些雜質(zhì)的檢測極具挑戰(zhàn)性。根據(jù)計算，假設(shè)DAR為4，藥物-連接子中間體中3.0 wt%的小分子雜質(zhì)（若均可偶聯(lián)）將導(dǎo)致最終ADC DS/DP中0.15 wt%的雜質(zhì)水平。下表詳細(xì)列出了中間體雜質(zhì)的計算案例及其后果。

3. 游離藥物相關(guān)雜質(zhì)（FDRIs）的控制

游離藥物、游離藥物-連接子及其雜質(zhì)等未偶聯(lián)的細(xì)胞毒性藥物形式被定義為“FDRIs”，它們直接影響ADC的安全性和有效性。控制水平應(yīng)基于患者風(fēng)險（安全性/有效性）、工藝表征和穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。對于已上市ADC，建議采用風(fēng)險導(dǎo)向策略，反映基于患者潛在影響的雜質(zhì)不確定性和關(guān)鍵性。以Brentuximab vedotin為例，研究證實其偶聯(lián)藥物MMAE在劑量高達2.7 μg/kg時無藥理活性，相當(dāng)于活性ADC給藥劑量1.8 mg/kg時的0.15 wt%。因此，游離MMAE可被歸類為“非異常活性”雜質(zhì)，若其在DS中含量低于0.15 wt%，則不構(gòu)成安全擔(dān)憂。

若在開發(fā)和驗證中持續(xù)觀察到低水平的FDRI，且雜質(zhì)非異常活性，則可從常規(guī)控制系統(tǒng)中移除該測試。

4. 未偶聯(lián)抗體（DAR0）的控制

早期ADC工藝可能導(dǎo)致大量未偶聯(lián)抗體（DAR0物種）殘留，可能阻斷結(jié)合位點影響療效。然而，體內(nèi)體外研究表明DAR0在許多情況下并非有效抑制劑，甚至可能有益。現(xiàn)代偶聯(lián)技術(shù)能實現(xiàn)高效偶聯(lián)和低水平的DAR0。若能證明低且一致的DAR0水平，可能無需在ADC DS和DP放行規(guī)格中設(shè)定該標(biāo)準(zhǔn)。

5. DAR與效力的控制

ADC的效力通常包含在DS和DP的放行規(guī)格中。對于半胱氨酸連接的ADC（如Brentuximab vedotin），可通過色譜分析DAR分布并計算平均DAR。對于賴氨酸連接的ADC（如Trastuzumab emtansine），平均DAR通常通過UV光譜測定，而質(zhì)譜或成像等電聚焦可用于定量藥物分布。下圖展示了Trastuzumab emtansine在小規(guī)模和商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)下的藥物分布對比，兩者平均DAR均為3.5，顯示出高度可比性。

對于定點偶聯(lián)的工程化抗體，DAR分布問題較少，僅需在產(chǎn)品表征和可比性研究中檢查。

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三、工藝變更與可比性研究

ADC制造工藝的變更可能發(fā)生在開發(fā)期間或獲批后，旨在提高穩(wěn)健性、簡化工藝、變更場地或規(guī)模等。由于其復(fù)雜性，確定如何充分評估變更影響面臨額外挑戰(zhàn)。

1. 藥物、連接子或藥物-連接子中間體的變更

作為小分子，這些中間體結(jié)構(gòu)表征明確。若分析評估顯示變更前后結(jié)構(gòu)相同、純度/雜質(zhì)譜可比且反應(yīng)性一致，通常無需對ADC DS或DP進行可比性研究。若存在顯著差異，需進行風(fēng)險評估，重點關(guān)注雜質(zhì)對最終ADC產(chǎn)品安全性和有效性的風(fēng)險。下圖展示了針對藥物-連接子中間體工藝變更的可比性評估決策樹。

2. mAb中間體的變更

mAb中間體作為大分子，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。變更應(yīng)評估細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)、純化等環(huán)節(jié)。若mAb中間體可比性成功證明純度、雜質(zhì)和穩(wěn)定性一致，則無需在DS和DP階段進一步行動。若可比性未建立，但DS和/或DP可比性已證明，則需對mAb中間體差異進行風(fēng)險評估。下圖展示了針對mAb中間體工藝變更的可比性評估決策樹。

3. 偶聯(lián)工藝與DS制劑變更

變更應(yīng)與其他大分子產(chǎn)品類似處理。一般建議僅在ADC DS層面進行基于風(fēng)險評估的可比性研究，證明變更前后純度、雜質(zhì)、效力、穩(wěn)定性和安全性可比。若變更導(dǎo)致DS不可比或可能影響DP質(zhì)量，需考慮進行DP層面的可比性評估。下圖展示了針對偶聯(lián)工藝和DS制劑變更的可比性評估決策樹。

4. 可比性研究的質(zhì)量屬性選擇

下表列出了針對mAb中間體、藥物-連接子中間體、DS和DP進行可比性研究時推薦的質(zhì)量屬性。

對于mAb中間體，建議比較純度、結(jié)合特異性、一級結(jié)構(gòu)和高階結(jié)構(gòu)。對于DS，建議包括DAR、純度、效力、一級和高階結(jié)構(gòu)。對于DP，除上述外還需關(guān)注顆粒、無菌、pH等。

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四、驗證策略

ADC的制造涉及多步驟，傳統(tǒng)驗證（PPQ）要求DS使用驗證過的mAb和藥物-連接子中間體生產(chǎn)，這種線性序列可能延遲上市申請。下圖展示了三種不同的驗證策略場景。

替代策略（如Scenario B和C）允許各制造階段獨立驗證或并行工作，通過證明工藝輸入具有代表性（如使用GMP批次生產(chǎn)的穩(wěn)定性批次作為輸入），從而節(jié)省時間并高效利用材料。

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五、N-亞硝胺風(fēng)險評估

必須對所有ADC產(chǎn)品進行N-亞硝胺風(fēng)險評估，考慮合成藥物-連接子中間體、生物mAb中間體、偶聯(lián)DS和DP等各步驟。若中間體存在風(fēng)險，需評估下游步驟（如色譜或UF/DF）的消除能力。DS和DP通常低溫儲存，反應(yīng)動力學(xué)極慢，形成N-亞硝胺可能性低。

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六、CTD文檔結(jié)構(gòu)

ICH M4Q提供了注冊資料CMC部分的統(tǒng)一結(jié)構(gòu)指導(dǎo)。下圖展示了兩種可能的ADC通用技術(shù)文檔結(jié)構(gòu)。

Option A：單一DS文件夾，藥物、連接子、藥物-連接子和裸mAb作為DS中間體，其信息嵌套在DS模塊中。

Option B：多個獨立的3.2.S文件夾（分別針對ADC DS、藥物-連接子中間體、mAb中間體），每個文件夾包含一套完整的文檔。作者推薦Option B，因其便于行業(yè)準(zhǔn)備和監(jiān)管機構(gòu)審評，且簡化生命周期管理。

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結(jié)語

與2000年代早期相比，ADC領(lǐng)域已在技術(shù)、偶聯(lián)工藝和過程一致性理解方面取得重大進步。監(jiān)管期望應(yīng)區(qū)分“監(jiān)控點”和“放行規(guī)格”，并對現(xiàn)代偶聯(lián)技術(shù)產(chǎn)品設(shè)定科學(xué)合理的控制策略。應(yīng)接受基于科學(xué)的工藝變更評估方法，并采用靈活的CTD文檔結(jié)構(gòu)，以促進ADC的發(fā)展。

參考資料：

CMC Regulatory Considerations for Antibody-Drug Conjugates. J Pharm Sci. 2023 Dec;112(12):2965-2980.

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