1.文獻(xiàn)信息

【題目】A temporally functional composite hydrogel scaffold for cranial defect repair via sequential modulation of angiogenesis and osteogenesis

【期刊】Theranostics

【影響因子】13.3

【關(guān)鍵詞】絲素蛋白水凝膠；丹酚酸B；礦化水凝膠微球；顱骨缺損；時(shí)間調(diào)控

2.文獻(xiàn)摘要

顱骨大面積缺損修復(fù)仍是臨床重大挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)材料主要作為惰性填充物，無法滿足顱骨再生的復(fù)雜生物學(xué)需求。特別是它們?nèi)狈f(xié)調(diào)血管生成與骨生成的時(shí)間特性。本研究旨在開發(fā)一種時(shí)間功能復(fù)合支架，以動態(tài)調(diào)控再生微環(huán)境并促進(jìn)序貫血管化骨再生。設(shè)計(jì)了一種基于絲素蛋白的水凝膠系統(tǒng)，整合了載有丹酚酸B（SalB）的緩釋水凝膠和礦化絲素蛋白水凝膠微球（MSFM）。通過材料表征評估支架的結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能及藥物釋放行為。體外實(shí)驗(yàn)評估內(nèi)皮細(xì)胞遷移、管形成、血管生成相關(guān)基因表達(dá)以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的成骨分化潛能。通過大鼠顱骨缺損模型的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)分析進(jìn)一步驗(yàn)證體內(nèi)修復(fù)效果。表征證實(shí) OSFM 微凝膠呈均勻球形，具有多孔內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并表現(xiàn)出 OGP 的持續(xù)釋放。體外實(shí)驗(yàn)中， OSFM 與BMSCs表現(xiàn)出優(yōu)異的細(xì)胞相容性，與SFM相比顯著增強(qiáng)了細(xì)胞增殖、ALP活性及礦化結(jié)節(jié)形成（p < 0.05）。管形成實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)表明， OSFM 條件培養(yǎng)基促進(jìn)了 HUVEC 遷移和血管生成。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將 OSFM +PCL支架植入大鼠顱骨缺損后，其骨再生效果顯著優(yōu)于對照組、PCL組和SFM+PCL組。 OSFM +PCL組在第8周時(shí)骨體積分?jǐn)?shù)達(dá)到52.31 ± 4.27%，顯著高于其他組的23.65 ± 3.81%、30.42 ± 3.96%和37.86 ± 4.12%（p < 0.05）。組織學(xué)染色證實(shí)了更成熟的骨形成、豐富的膠原沉積以及新骨與支架間的緊密整合。免疫組化顯示RUNX2、氰酸鹽和CD31表達(dá)上調(diào)，表明成骨和血管生成增強(qiáng)。這種時(shí)間功能復(fù)合支架通過利用其組分的差異降解動力學(xué)，實(shí)現(xiàn)了“先血管生成后成骨”的順序策略。研究結(jié)果證明了一種具有強(qiáng)烈生物活性和轉(zhuǎn)化潛力的仿生時(shí)間調(diào)控方法，可用于顱骨再生。

3.研究結(jié)果

圖1. 通過序貫促進(jìn)血管生成與成骨作用設(shè)計(jì)的顱骨缺損修復(fù)時(shí)間調(diào)控水凝膠復(fù)合支架示意圖。

圖2. 時(shí)間功能復(fù)合水凝膠支架的合成與表征

圖3.復(fù)合水凝膠支架的生物相容性。(A)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）活/死染色。比例尺=100 μm 。(B)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）活/死染色。比例尺=100 μm 。（C-D）與復(fù)合支架共培養(yǎng)的BMSCs和HUVECs細(xì)胞活力（p<0.01）。

圖4.復(fù)合支架促進(jìn)血管生成的體外功能評估。(A)0小時(shí)和24小時(shí)的遷移實(shí)驗(yàn)。比例尺=500 μm 。(B)血管生成實(shí)驗(yàn)示意圖。（C-E）遷移和管形成實(shí)驗(yàn)的定量分析。(F)4小時(shí)和8小時(shí)的管形成實(shí)驗(yàn)。比例尺=200 μm 。(G)血管生成相關(guān)基因表達(dá)的RT-qPCR分析（p<0.001）。

圖5.復(fù)合支架促進(jìn)體外成骨功能的評估。（A-B）第7天ALP染色及定量分析。比例尺=100 μm 。（C-D）第7天ARS染色及定量分析。比例尺=100 μm 。(E)成骨相關(guān)基因表達(dá)的定量PCR分析（p<0.001）。

圖6.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的轉(zhuǎn)錄組測序分析。（A-B）對照組與SalB@ SFH +MSFM組間的差異表達(dá)基因（DEGs）。（C-D）DEGs的GO富集分析。（E-F）DEGs的 KEGG 通路富集分析。（G-H）DEGs的 GSEA 。

圖7.顱骨缺損修復(fù)的顯微CT與組織學(xué)分析。(A)顱骨缺損模型建立方案。比例尺=5mm。(B)大鼠顱骨缺損手術(shù)示意圖。（C-D）大鼠顱骨樣本在4周和8周時(shí)的顯微CT重建及定量分析。比例尺=1mm。（E-F）再生骨組織的H&E染色與Masson三色染色。比例尺= 200μm 和50 μm 。

圖8. 顱骨缺損修復(fù)的體內(nèi)組織學(xué)分析。（A-C）4周和8周時(shí)氰酸鹽、 OPN 和RUNX2的免疫組化染色。比例尺 = 200 μm 和50 μm 。（D-F）通過免疫組化對氰酸鹽、 OPN 和RUNX2表達(dá)的定量分析。（G-H）4周時(shí)CD31和 α -SMA的免疫熒光染色及定量分析。比例尺 = 100 μm 。

圖9.體內(nèi)生物相容性評估。各實(shí)驗(yàn)組大鼠器官切片（心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟）的H&E染色。比例尺=200 μm 。